气肿疽梭菌PCR-ELISA检测方法的建立

作     者：方程 

作者单位：延边大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金鑫;陈西钊

授予年度：2021年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：气肿疽梭菌 NagH基因 PCR-ELISA 检测方法 

摘      要：气肿疽是由气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的,主要感染牛、羊等反刍动物的一种急性、热性、败血性和高致死性传染病。病原体易对受损动物机体侵袭,芽孢由咽喉或口腔向血液或受伤组织入侵。临床证实,死亡率与年龄具有相关性,年龄越大,感染率及病死率相对越低,且地方性流行特征明显。若没有进行针对性干预,会增加疾病死亡率,养殖户营业额下降。气肿疽前期症状隐匿,是一种高死亡率、低治愈率传染病,临床防控难度较大,不利于畜牧业正常发展,进而对人类生命健康产生威胁,当前在世界范围内引起高度重视。因此,本试验建立了一种对于气肿疽梭菌的流行病学调查和诊断的简便、特异、敏感的气肿疽梭菌PCR-ELISA检测方法。本试验依据GenBank上发布的气肿疽梭菌NagH基因序列（登录号KY064176.1）应用Primer Premier软件设计合成两对特异性引物,并在其中一对引物的上、下游5’端分别标记非放射性引物生物素（Bio）和地高辛（Dig）。将气肿疽梭菌阳性样本作为研究对象,对基因组DNA提取后PCR扩增,目的基因片段获取后纯化回收。将其向pMD-19T simple载体克隆,质粒PCR后双酶切,将取得的阳性结果送至生物公司检验。优化PCR产物稀释度、封闭时间、链酶亲和素浓度、PCR产物稀释度、HRP-抗地高辛抗体显色时间及稀释度,选择最合适反应条件,依据PCR-ELISA步骤操作。选取经PCR检测后35份呈阴性气肿疽梭菌样本,对其进行PCR-ELISA检测,对OD470nm值测定,对气肿疽梭菌病PCR-ELISA临界值计算,选择更准确判断标准。接下来倍比稀释气肿疽梭菌基因组DNA,应用PCR-ELISA法检测,对其敏感性确定。选择合适反应条件,将巴氏杆菌、腐败梭菌、D型及E型产气荚膜梭菌基因组DNA作为反应模版,对PCR-ELISA法检测特异性判断。将150份待检牛抗凝血样本作为研究对象,分别检测不同时间及相同时间下包被酶标板重复性试验稳定性,另外对比常规法与该检测方法检测稳定性,探究该检测方法应用可行性。结果表明,常规PCR检测后条带大小约为1 107 bp,与Genbank上发布的气肿疽梭菌基因序列[KY064176.1]的同源性达到99%,证明扩增的目的片段为气肿疽梭菌。经优化实验各个环节,得出如下结论:气肿疽梭菌阴性样本临界值为0.174,阴性是指样本OD470om值≤0.234,反之为阳性。封闭适宜时间为60 min,底物适宜显色时间为15 min,PCR产物及HRP标记抗地高辛抗体适宜稀释度分别为30倍、2 000倍,链酶亲和素适宜浓度为5 μg/mL。气肿疽梭菌DNA经PCR-ELISA法检测结果显示,其最低浓度为2.2 pg/μL。与常规PCR法检测出的220 pg/μL相比敏感性高100倍,且与D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌等之间无交叉反应,具有较强的特异性。对150份待检牛抗凝血进行检测,阳性检出率为21.3%,高于常规PCR法的16.0%。