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巨大芽孢杆菌25-B对普通生酮基古龙酸菌伴生作用机理的探究

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食品科技 2013年第6期38卷 35-39页

作者：罗曼吕淑霞郭智勇潘健张良于晓丹张忠泽陈宏权沈阳农业大学生物科学技术学院沈阳110866 中国科学院沈阳应用生态研究所沈阳110016 东北制药总厂Vc公司沈阳110028

为明确Vc混菌发酵中巨大芽孢杆菌25-B(俗称大菌)对普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)的伴生作用机理,通过摇瓶发酵实验考察大菌胞外组分上清液、胞内组分上清液、全组分超声上清液对小菌伴生活性的影响,并采用超滤分级分离技术,观察大菌胞... 详细信息

为明确Vc混菌发酵中巨大芽孢杆菌25-B(俗称大菌)对普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)的伴生作用机理,通过摇瓶发酵实验考察大菌胞外组分上清液、胞内组分上清液、全组分超声上清液对小菌伴生活性的影响,并采用超滤分级分离技术,观察大菌胞外不同相对分子质量区间的组分对小菌生长和产酸的促进作用。结果表明,大菌培养12h(产芽孢前)的胞内组分上清液和大菌培养36h(大多数芽孢随母细胞裂解释放)的胞外组分上清液均能有效促进小菌生长和产酸,且二者能力相当,说明活性物质应该是在细胞内产生,并随着芽孢形成时母细胞裂解而释放,从而对小菌产生促进作用;大菌胞外组分上清液中大于30000的组分对小菌生长和产酸的促进作用最明显。

关键词：普通生酮基古龙酸菌巨大芽孢杆菌25-B 2-酮基-L-古龙酸

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伴生菌对普通生酮基古龙酸菌发酵的影响

泰州职业技术学院学报 2013年第2期13卷 76-78页

作者：刘杰胡少斌常芳陈红江苏江山制药有限公司江苏靖江214500

为了实现普通生酮基古龙酸菌的单独培养和产酸,采用伴生菌巨大芽孢杆菌生长时分泌的胞外液、胞内液混合的培养方法,通过测定普通生酮基古龙酸菌单独培养时活菌数及摇瓶发酵中2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)生成情况,研究添加伴生菌胞内液和胞... 详细信息

为了实现普通生酮基古龙酸菌的单独培养和产酸,采用伴生菌巨大芽孢杆菌生长时分泌的胞外液、胞内液混合的培养方法,通过测定普通生酮基古龙酸菌单独培养时活菌数及摇瓶发酵中2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)生成情况,研究添加伴生菌胞内液和胞外液对普通生酮基古龙酸菌生长和产酸的影响。结果表明:普通生酮基古龙酸菌利用一定量的伴生菌胞外液和胞内液可以实现普通生酮基古龙酸菌的单独生长和正常产酸。

关键词：普通生酮基古龙酸菌二步发酵单菌发酵伴生菌胞内液胞外液

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提高维生素C二步发酵种子质量的方法

煤炭与化工 2024年第5期47卷 144-147页

作者：胡静刘丽华朱娜苏宏儒王婧米帅东石药集团维生药业(石家庄)有限公司河北石家庄050000 石家庄市食品药品检验中心河北石家庄050000 石家庄市维生素C技术创新中心河北石家庄050000 河北省营养强化剂技术创新中心河北石家庄050000

通过在维生素C二步种液培养基中添加半胱氨酸或(和)氯化钙的方法,研究了这2种物质对二步菌种生长和产2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的影响。结果表明,在二步种子培养基中加入适量的半胱氨酸和(或)氯化钙能够促进普通生酮基古龙酸菌生长,提高... 详细信息

通过在维生素C二步种液培养基中添加半胱氨酸或(和)氯化钙的方法,研究了这2种物质对二步菌种生长和产2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的影响。结果表明,在二步种子培养基中加入适量的半胱氨酸和(或)氯化钙能够促进普通生酮基古龙酸菌生长,提高菌体密度,协调混菌比例,提高种子质量,并提高后续发酵2-酮基-L-古龙酸生成速率,缩短发酵周期。在种子培养基中同时加入0.3 g/L半胱氨酸和0.6 g/L氯化钙培养效果最显著:种液中普通生酮基古龙酸菌浓度提高30.77%,发酵周期缩短8.33%,2-酮基-L-古龙酸生成速率提高9.31%。

关键词：二步发酵种子半胱氨酸氯化钙普通生酮基古龙酸菌菌体密度 2-酮基-L-古龙酸

醇醛脱氢酶的分离纯化及其基因文库的构建和筛选

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生物工程学报 2007年第5期23卷 891-895页

作者：谢莉张铎窦燕峰张丽萍赵宝华河北师范大学生命科学院石家庄050016 石家庄制药集团石家庄050051 河北省生物研究所石家庄050081

在维生素C的发酵生产过程中,普通生酮基古龙酸菌S2(Ketogulonigenium vulgare)能产生醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,QSeph... 详细信息

在维生素C的发酵生产过程中,普通生酮基古龙酸菌S2(Ketogulonigenium vulgare)能产生醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,QSepharose High Performance柱层析等过程,从普通生酮基古龙酸菌S2发酵液中分离纯化了醇醛脱氢酶,并用该纯化酶免疫新西兰兔制备出了合格抗血清。同时,普通生酮基古龙酸菌S2基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切后,与黏粒载体pKC505连接,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5浕,构建了基因组文库。最后应用免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)从12000个克隆子中筛选得到一个阳性克隆K719#。通过检测该基因工程菌的活性,表明K719#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中获得了高效表达,这为简化VC的生产工艺奠定了基础。

关键词：普通生酮基古龙酸菌醇醛脱氢酶分离纯化免疫酶斑点技术文库筛选

维生素C两步发酵中关键步骤的分子生物学研究

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维生素C两步发酵中关键步骤的分子生物学研究

作者：王虹中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

在维生素C两步发酵工艺中,第一步为醇糖转化,即在葡糖杆菌作用下D-山梨醇转化为L-山梨糖;第二步为糖酸转化,在普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗称小菌)与其伴生菌(俗称大菌)组成的混合菌系的作用下L-山梨糖转化为维生素... 详细信息

关键词：普通生酮基古龙酸菌山梨糖脱氢酶葡糖杆菌 Tn5诱变

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维生素C两步发酵中关键酶的研究

维生素C两步发酵中关键酶的研究

作者：姜泽慧沈阳药科大学

学位级别：硕士

我国首创的VC两步发酵法是惟一应用于大规模工业生产VC微生物转化法,其第一步为醇糖转化,由葡糖杆菌(俗称一步菌)将D-山梨醇转化为L-山梨糖;第二步为糖酸转化,由普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)与其伴生菌(俗称大菌)的混合菌系将L-山梨糖... 详细信息

我国首创的VC两步发酵法是惟一应用于大规模工业生产VC微生物转化法,其第一步为醇糖转化,由葡糖杆菌(俗称一步菌)将D-山梨醇转化为L-山梨糖;第二步为糖酸转化,由普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)与其伴生菌(俗称大菌)的混合菌系将L-山梨糖转化为VC前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。两步发酵法的糖酸转化效率很高,但需要两步发酵,三种微生物共同参与。若能应用现代生物技术将参与两步发酵的相关基因整合在单一宿主菌中表达,构建一步发酵工程菌,可简化生产工艺、提高工艺稳定性、节省生产成本,从而提升我国VC产业的竞争力和科技地位。本研究从VC生产菌株中分离转化的相关基因,为一步菌的构建奠定基础。本课题组已从小菌基因文库中分离得到了一种山梨糖脱氢酶基因(sdh),其表达产物山梨糖脱氢酶(SDH)能在体外将L-山梨糖转化为2-KGA,但在大肠杆菌体内却不能完成转化。本研究试图通过转座诱变和突变基因分析筛选VC两步发酵菌中醇糖和糖酸转化的其他相关基因。利用Tn5转座系统对酮古龙酸菌SCB329进行了诱变,筛选不能进行糖酸转化的突变株。从750株SCB329突变株中得到1株不产酸的变株,该突变株可望用于研究糖酸转化转化机制或寻找相关基因。建立了葡糖杆菌的Tn5诱变系统,实现了Tn5转座对葡糖杆菌的诱变,为葡糖杆菌山梨醇代谢途径研究及相关基因分离奠定了基础。利用SOLEXA技术对酮古龙酸菌SCB329进行全基因组分析,测序结果通过软件分析和数据库比对,预测得到了基因组上山梨糖脱氢酶的开放阅读框。从SCB329基因组上扩增出7个可能的山梨糖脱氢酶的基因编码框,并连接入带有小菌启动子的表达载体pBMP3上,在大肠杆菌中进行表达。经活性染色、体外转化反应等方法考察表达产物的活性,发现其中1个读框的表达产物具有山梨糖脱氢酶活性。该基因编码579个氨基酸残基组成的蛋白,pI为4.15,其生物活性严格依赖PQQ,能够催化多种含羟基及羰基化合物脱氢,并能在体外将L-山梨糖直接转化为2-KGA。根据该蛋白的上述特性,将其命名为醇醛脱氢酶(AADH)。该酶的发现对于SCB329糖酸转化机制的研究具有一定价值。

关键词：普通生酮基古龙酸菌葡糖杆菌 Tn5诱变基因组测序山梨糖脱氢酶醇醛脱氢酶

基于SDH酶促反应的2-KGA发酵调控研究

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基于SDH酶促反应的2-KGA发酵调控研究

作者：王振兴东北大学

学位级别：硕士

2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)是维生素C的重要前体物质。目前,2-KGA主要通过“二步发酵法”获得,其中“二步发酵法”的第二步由L-山梨糖生成2-KGA的混菌发酵最为关键。本文以25b菌系为研究对象,从菌体生长及L-山梨糖脱氢酶(SDH)酶促反应角度... 详细信息

2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)是维生素C的重要前体物质。目前,2-KGA主要通过“二步发酵法”获得,其中“二步发酵法”的第二步由L-山梨糖生成2-KGA的混菌发酵最为关键。本文以25b菌系为研究对象,从菌体生长及L-山梨糖脱氢酶(SDH)酶促反应角度出发,对2-KGA发酵过程进行功能性划分,进而对2-KGA发酵过程中种液的混菌比例关系、发酵环境因子进行了较为系统的分时段优化调控研究。种液混菌比例关系的实验结果显示：当将种液中***菌浓OD650控制在0.4～0.5时,可以有效促进发酵过程中大菌的生长,进而大菌裂解后释放了更多的活性物质;种液中小菌浓度增加,则其发酵稳定期的小菌菌浓也随之增加,当种液中***菌浓OD650提高到0.15以上,可以显著促进发酵过程产酸,糖酸转化率达到80%以上。通过对发酵过程中菌体生长及产酸过程的研究,将2-KGA发酵过程划分为三个功能时段,即G1期(***生长期,0～20h)、G2期(***生长期,20～30h)、P期(2-KGA合成积累期,30h至发酵终点),分别考察了主要环境因子对各阶段发酵的影响,并分阶段优化了发酵条件。结果表明：(1)分段pH调控程序：G1pH7.0→G2pH6.0→P pH7.0,可以分别有效提高大、小菌生长速率5.5%、83.3%,2-KGA产量提高6%;(2)分段温度调控程序：G132℃→G229℃→P35℃,可以有效提高2-KGA的发酵效率,大、小菌生长速率分别提高6.9%、21.4%,2-KGA产量提高5.2%;(3)分段通风量调控程序：发酵摇瓶(750mL),G1期为70mL装量;G2期和P期为120mL装量,可以分别提高大菌平均生长速率、小菌平均生长速率和古龙酸生产速率25.9%、57.1%和12.4%;(4)0.03～0.05%的Mg2+离子浓度可以有效促进菌的生长,而0.07%的Mg2+离子浓度可以促进2-KGA的合成,但抑制两菌的生长;(5)培养基添加0.3%的MnCl2时,可有效促进大小菌的生长及2-KGA转化。以上研究结果为探索2-KGA发酵过程中菌间作用机制及25b菌系发酵工艺的优化升级提供了理论依据。

关键词： 2-酮基-L-古龙酸二步发酵法发酵调控酶促反应普通生酮基古龙酸菌

Vc混菌发酵中短小芽孢杆菌铁载体促产酸作用机制的研究

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Vc混菌发酵中短小芽孢杆菌铁载体促产酸作用机制的研究

作者：张倩沈阳农业大学

学位级别：硕士

本论文以维生素C(Vc)混菌发酵中普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare 25B-1)(又称产酸菌)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus SH-B9)(又称伴生菌)为研究对象,利用微生物生理生化与分子生物学技术探究*** SH-B9产铁载体的促产... 详细信息

本论文以维生素C(Vc)混菌发酵中普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare 25B-1)(又称产酸菌)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus SH-B9)(又称伴生菌)为研究对象,利用微生物生理生化与分子生物学技术探究*** SH-B9产铁载体的促产酸作用机制。主要研究结果如下:(1)本研究发现不同伴生菌的促产酸能力具有差异,表现为:生长特性的差异,即生长速度慢、延滞期长的伴生菌能延长发酵周期,生长速度快、延滞期短的伴生菌,其促产酸能力也较差;产铁载体的能力差异,表现为:铁载体产量越高的菌株其伴生能力也越强。为此选择伴生能力较好的*** SH-B9作为研究对象进行深入研究。(2)添加不同浓度的Fe对*** SH-B9产铁载体和*** 25B-1产酸具有影响。随着添加的Fe浓度的升高,*** SH-B9的铁载体产量逐渐下降。在混菌发酵体系中,随着添加的Fe浓度的升高,2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KGA)产量增加;在单菌发酵体系中,添加1μmol/L的Fe能提高2-KGA产量,但继续提高Fe浓度,2-KGA产量随之降低,可能是由于*** 25B-1中铁平衡被打破,受到自身氧化胁迫。(3)截留分子量不超过5000 Da的*** SH-B9胞外物,而后利用真空冷冻干燥技术得到超滤粉末,为鉴定铁载体在极性差别大的有机溶剂中的溶解性,利用铬天青(Chromeazurol S,CAS)能特异性鉴定铁载体的原理,研究发现*** SH-B9分泌的铁载体中有极小部分可以溶于三氯甲烷、微溶于丙酮、部分溶于甲醇,将不溶部分过滤并溶于超纯水后,经CAS检测证明其中含有铁载体。推测*** SH-B9所产的铁载体是混合型铁载体。利用葡聚糖凝胶LH-20、20%甲醇水溶液对超滤粉末进行初步的分离纯化、CAS检测液对收集液进行检测,收集活性最高的组分通过高效液相色谱分析,研究发现葡聚糖凝胶LH-20的分离效果较高,能够得到较纯的铁载体。(4)将纯化得到的铁载体以不同浓度添加到单菌发酵体系中,发现铁载体能够显著促进*** 25B-1产酸,且随着添加的铁载体浓度的升高,2-KGA产量也得以提高:在添加的铁载体浓度为500μg/L时,2-KGA产量提高了71.45%。(5)铁载体能够诱导*** 25B-1的铁摄取代谢系统中重要基因(内膜蛋白基因exbB、周质蛋白基因tonB、铁摄取调节蛋白基因fur)的表达。铁载体能够诱导***25B-1中与呼吸链电子传递相关的铁硫蛋白基因的表达量并提高与ATP合成相关的关键基因的表达量,同时也提高能利用铁作为辅因子的抗氧化物酶基因的表达,从而解除*** 25B-1自身受到的氧化胁迫。铁载体能够诱导*** 25B-1中产酸关键酶基因的表达量,从而提高2-KGA的产量。

关键词：普通生酮基古龙酸菌短小芽孢杆菌铁载体 2-酮基-L-古龙酸基因表达

维生素C两步发酵中关键酶山梨糖脱氢酶及其辅酶的研究

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维生素C两步发酵中关键酶山梨糖脱氢酶及其辅酶的研究

作者：董方厦门大学

学位级别：硕士

在维生素C两步发酵工艺中,第一步为醇糖转化,即在葡糖杆菌作用下D-山梨醇转化为L-山梨糖;第二步为糖酸转化,在普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗称小菌)与其伴生菌(俗称大菌)组成的混合菌系的作用下L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(KGA)。维生素C两步发酵实质上就是D-山梨醇和L-山梨糖的专一性生物氧化过程。阐明这一系列生物氧化过程的生化反应机制对于指导维生素C的遗传育种甚至通过代谢工程构建由山梨醇到KGA的一步发酵工程菌,都具有重要意义。本课题组已从小菌细胞裂解物中分离得到了催化山梨糖生物氧化的一种关键酶──山梨糖脱氢酶(SDH),该酶能够将L-山梨糖直接转化为KGA;同时构建了小菌的基因文库,并以SDH的抗体筛选文库,分离得到编码SDH的基因(sdh)。本文在上述工作基础上,首先在大肠杆菌中对山梨糖脱氢酶进行了高效表达,对表达产物进行了纯化,研究了该酶的最适反应温度、最适反应pH值、酶稳定性、米氏反应常数、酶的激活剂和抑制剂、金属离子的激活与抑制作用等重要性质。研究葡糖杆菌对山梨糖脱氢酶的影响。以氨甲酰化酶基因(hyuC)为报告基因,构建了山梨糖脱氢酶-氨甲酰化酶融合表达载体,在大肠杆菌中可以同时检测到山梨糖脱氢酶和氨甲酰化酶活性;而在葡糖杆菌中,只能检测到氨甲酰化酶活性,未检测到山梨糖脱氢酶活性。质粒稳定性实验和质粒回转实验说明该质粒在葡糖杆菌中稳定存在。由于hyuC基因位于sdh基因下游,融合基因的转录和翻译是从山梨糖脱氢酶到氨甲酰化酶,氨甲酰化酶在葡糖杆菌中表达说明包含山梨糖脱氢酶在内的融合蛋白能够在葡糖杆菌中转录并翻译,山梨糖脱氢酶可能被宿主的酶系降解失活。通过体外实验也证实葡糖杆菌裂解物对山梨糖脱氢酶具有降解作用。将山梨糖脱氢酶与葡糖杆菌裂解液保温过夜后,通过SDS-PAGE检测到电泳图谱上约60kD和49kD处出现两条明显条带,对这两条带进行蛋白质N-端序列分析,结果显示其N端的前3个氨基酸残基均为谷氨酰胺-苏氨酸-丙氨酸,推测49kD的蛋白条带是由60kD山梨糖脱氢酶蛋白C-端降解产生。对预测的sdh读框N-端蛋氨酸至谷氨酰胺之间23肽氨基酸序列分析,发现23个氨基酸中大部分氨基酸为疏水氨基酸,并与醇脱氢酶的信号肽序列有38%的同源性,推测山梨糖脱氢酶N-端的23肽可能是一段信号肽,与该酶在细胞膜上的定位相关。吡咯喹啉醌,又称吡咯并喹啉苯醌,英文名:pyrroloquinoline quinone,缩写为PQQ,另名为Methoxatin,化学名为,4,5-二氢-4,5-二氢化-1-氢吡咯(2,3f)醌-2,7,9-三羧酸,是一种新发现的多种氧化还原酶的辅基,不同于已知的辅酶或辅基(NAD、NADP、FMN、FAD、辅酶A、辅酶Q),目前被认为是一种新的B族维生素,具有一定的医药应用前景。PQQ的生理学功能主要表现在:刺激某些植物发育及微生物和人体细胞生长,作为动物体生长发育的必需因子,清除自由基保护机体免受自由基损害,防治肝损伤;促进神经生长因子合成等。在细菌中PQQ一般是由一组排列成簇的相关基因控制合成的,根据不同来源PQQ基因的同源性和对应关系可将PQQ基因归为7类,即pqqA、B、C、D、E、F、G。不同细菌合成PQQ所需基因数目不等。本文通过从土壤中筛选得到了两株PQQ高产菌株,产量达到60μg/ml。并对该两种菌株进行了16S-RNA鉴定。

关键词：普通生酮基古龙酸菌山梨糖脱氢酶葡糖杆菌吡咯喹啉醌