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晚期氧化蛋白产物抑制CD4＋CD25-T细胞向CD4＋CD25＋调节性T细胞转化

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中华实验外科杂志 2018年第10期35卷 1902-1904页

作者：李凯白晓峰冯梅石华王元林孙兆林徐述雄贵州省人民医院泌尿外科贵阳550002 遵义医学院 563003

目的探讨晚期氧化蛋白产物（AOPP）对CD4＋CD25-T细胞向CD4＋CD25-T调节性T细胞（Tregs）转化的影响及机制。方法将CD4＋CD25-T细胞按1×10^6／孔培养于平底96孔板，依据是否加入AOPP分为3组：对照组（加入人血清白蛋白200μg／m1）；A... 详细信息

目的探讨晚期氧化蛋白产物（AOPP）对CD4＋CD25-T细胞向CD4＋CD25-T调节性T细胞（Tregs）转化的影响及机制。方法将CD4＋CD25-T细胞按1×10^6／孔培养于平底96孔板，依据是否加入AOPP分为3组：对照组（加入人血清白蛋白200μg／m1）；AOPP组（加入AOPP200μg／m1）；抗氧化组（DPI100μmol／L预处理1h后再加入AOPP200μg／m1）。流式细胞仪检测各组细胞表型变化和DHE荧光强度，3H-TdR掺入法检测Tregs对效应T细胞（Teff）的免疫抑制功能，West-ernblot法检测细胞内磷酸化信号转导与转录激活因子5（p-STAT5）的变化。结果AOPP组中CD4＋CD25＋T细胞占（28．6±4．5）％、胞内因子Foxp3在CD4＋CD25＋T细胞中的表达率为（10．7±1．7）％，显著低于对照组细胞的相应值（73．8±10．7）％、（64．3±9．4）％（P=0．003，0．001）；抗氧化组细胞表型分别为（41．3±4.6．4）％、（22．3±3．0）％，转化较AOPP组多（P=0．049，0．004），低于对照组（P=0．011，0．002）。在Tregs：Teff为1：1的情况下，AOPP组Teff的每分钟脉冲数值（CPM）为17521．0±1703．8，显著高于对照组的9932．3±1142．9（P=0．003）；抗氧化组的Teff的CPM为15709．7±1272．9，高于对照组（P=0．004），但与AOPP组比较差异无统计学意义（P=0．214）。AOPP组DHE荧光强度为（163．0±11．5）％，较对照组（51．1±4．0）％高（P=0．000）；而抗氧化组DHE荧光强度（113．4±7．8）％较AOPP组低（P=0．003），高于对照组（P=0．000）。AOPP组p-STAT5表达较对照组低（P=0．006）；而抗氧化组p-STAT5表达较AOPP组显著性上调（P=0．008），但仍低于对照组（P=0．043）。结论AOPP抑制CD4＋CD25-T细胞向Tregs转化，其机制可能是通过氧化应激下调p-STAT5的表达。

关键词：晚期氧化蛋白产物白细胞介素.15 调节性T细胞 T细胞磷酸化信号转导与转录激活因子5

晚期氧化蛋白产物调节人肾小管上皮细胞自噬的研究

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重庆医学 2017年第25期46卷 3480-3483页

作者：章俊向晓红梁秀洁束双双姜婷婷郭婷婷汤珣南方医科大学珠江医院肾内科广州510280

目的探讨晚期氧化蛋白产物(AOPPs)对人肾小管上皮细胞(HK-2)自噬的影响。方法 AOPPs刺激HK-2细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和p62的表达;Western blot检测p38MAPK通路的激活;加入p38 MAPK抑制剂(SB203580)与AOPPs共处理,观察自噬的改变,加入自噬诱导剂雷帕霉素与AOPPs共处理,并用RT-qPCR和Western blot检测细胞周期抑制蛋白p27的表达,用BCA法检测细胞总蛋白,观察细胞肥大的改变。结果AOPPs下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1,上调p62的表达,并激活p38 MAPK通路;与AOPPs单独处理组相比,SB203580与AOPPs共处理组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin升高而p62降低;雷帕霉素与AOPPs共处理组p27的表达和细胞总蛋白下调。结论AOPPs通过激活p38 MAPK通路抑制HK-2细胞自噬,自噬抑制参与HK-2细胞肥大。

关键词：自噬 p38MAPK信号通路晚期氧化蛋白产物

晚期氧化蛋白产物对兔膝骨关节炎关节软骨及滑膜影响的实验研究

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晚期氧化蛋白产物对兔膝骨关节炎关节软骨及滑膜影响的实验研究

作者：余辉南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景骨关节炎（osteoarthritis, OA）是一种常见的慢性退行性关节疾病,典型的病理改变包括软骨的降解、滑膜的炎症、骨赘形成以及软骨下骨骨重塑等,因此它也是一种累及全关节的疾病。流行病学调查未发现其有明显的种族与地域性差异... 详细信息

研究背景骨关节炎（osteoarthritis, OA）是一种常见的慢性退行性关节疾病,典型的病理改变包括软骨的降解、滑膜的炎症、骨赘形成以及软骨下骨骨重塑等,因此它也是一种累及全关节的疾病。流行病学调查未发现其有明显的种族与地域性差异。在50岁以上的人群中,骨关节炎的致残比例约为2%～6%,这一比例在导致长期残疾的人类疾病中仅次于心血管疾病。由于其在中老年人中的发病率和致残率较高,骨关节炎被认为是影响人类健康最常见的疾病之一。据美国调查机构统计,因骨关节炎导致的医疗费用开支和其他经济损失年均高达1500亿美元,而其中一半以上消耗源于骨关节炎患者劳动能力的丧失。骨关节炎患者最主要的临床症状为关节疼痛,因而较其它关节疾病而言,骨关节炎更加容易限制患者的下肢运动能力,从而导致患者的长期劳动能力丧失,最终阻碍了社会与经济的发展。膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis, KOA）在骨关节炎中较常见,是一种慢性进行性骨关节病,多见于中老年人。据国外统计发现55～64岁的中老年人发病率高达40%。KOA病理改变主要为关节软骨基质崩解以及软骨细胞数量的减少。随着对膝骨关节炎的研究不断深入,越来越多的致病因素被发现,然而其病因及病理机制却仍不明确。各种因素导致的关节软骨损伤在生物学和形态学上高度一致,病变常常波及整个关节,包括关节软骨、软骨下骨、滑膜、关节滑液甚至韧带和周围的肌肉组织。膝骨关节炎发展的最终结果是关节正常结构的破坏以及关节功能的丧失,临床上患者常常因剧痛难忍而长期无法进行下肢活动。这些既影响了患者的生活质量也阻碍了社会的发展。因此,明确骨关节炎的发病机制对整个OA的防控工作具有越来越重要的意义。人体内氧化还原反应失衡导致活性氧类物质（Reactive Oxygen Species,ROS）积聚,最终引发氧化应激。机体在氧化应激状态下,大分子结构物质如蛋白质、脂质、DNA、RNA等因遭受氧化损伤而丧失正产的结构和功能,其中最易受到损伤的是蛋白质。而晚期氧化蛋白产物（Advanced Oxidation Protein Products, AOPPs）主要就是由体内血浆中白蛋白在氧化应激状态下经氧化修饰而生成的一种双酪氨酸蛋白交联物,AOPPs最早被发现是在慢性肾功能衰竭（Chronic Renal Failure,CRF）的患者血浆中,最终证实其主要是由血清中的白蛋白被机体内产生的氧自由基和反应性氧氧化而生成。临床进一步研究发现,慢性肾衰竭患者以及进行过血液透析的患者体内均存在较常人更高浓度的AOPPs,且与上述疾病与相关的长期并发症存在直接关系。经实验证实,晚期氧化蛋白产物也能在体外进行合成,通过血浆或纯化的血清白蛋白经次氯酸氧化反应即可得到,且加入的次氯酸剂量与晚期氧化蛋白产物生成浓度呈正相关性。蛋白被氧化后会生成一种特有的双酪氨酸结构,人体血浆中晚期氧化蛋白产物浓度与双酪氨酸及蛋白质糖基化标志物戊糖苷浓度呈正比,因此可以认为晚期氧化蛋白产物是一种良好的氧化应激标志物,可特异性的评价蛋白质受氧化的程度。近十几年的研究发现,晚期氧化蛋白产物除了在尿毒症患者体内集聚外,它还与众多疾病相关。其中在对血液透析患者的实验研究发现此类患者血浆中的晚期氧化蛋白产物浓度与颈动脉内膜中层厚度呈明显的相关性。同时又有研究发现慢性肾脏疾病（Chronic Kidney Disease, CKD）患者早期血浆中的晚期氧化蛋白产物浓度即显著升高,并随着肾功能恶化而进行性升高。Piwowar等发现2型糖尿病患者血浆晚期氧化蛋白产物浓度明显高于正常人,并与体内氧化及抗氧化标记物浓度呈相关性,研究还进一步发现有微血管病变的糖尿病患者,其血浆晚期氧化蛋白产物浓度也明显高于无病变患者。在对冠心病人群进行的一项研究中发现,冠心病患者血液中晚期氧化蛋白产物浓度明显高于正常人,并与冠心病的严重程度呈相关性,被认为是冠心病的一个独立危险因素。研究还发现冠心病病人血浆中晚期氧化蛋白产物与巯基比例明显升高,此研究认为晚期氧化蛋白产物与巯基比例升高可作为急性冠脉综合征发作的标志。过往文献报道有许多人类疾病都与晚期氧化蛋白产物的蓄积相关,如过敏性紫癜、IgA肾病、慢性炎症性肠病、肥胖、非酒精性脂肪肝、急性消化性溃疡等。临床上的研究促使学者们产生了对晚期氧化蛋白产物的兴趣,越来越多的动物实验被用来验证晚期氧化蛋白产物的作用。在一项大鼠在体实验研究中发现晚期氧化蛋白产物能刺激糖尿病大鼠肾脏组织内单核细胞趋化因子（Monocyte Chemotactic Protein-1）、转化生长因子（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）等促炎细胞因子的合成与释放,最终导致肾单位结构破坏,尿蛋白排出量增加及血肌酐升高。另一项兔的在体实验证实晚期

关键词：骨关节炎晚期氧化蛋白产物软骨滑膜基质金属蛋白酶

晚期氧化蛋白产物诱导间充质干细胞衰老及其对成骨/成脂分化影响

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晚期氧化蛋白产物诱导间充质干细胞衰老及其对成骨/成脂分化影响

作者：黄玉圣南方医科大学

学位级别：硕士

背景骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种以骨微结构破坏、骨量丢失,从而导致骨强度降低,骨组织脆性增加,并且容易诱发骨折的慢性全身性骨骼系统疾病。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一种有再生能力的多向分化细胞,其... 详细信息

背景骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种以骨微结构破坏、骨量丢失,从而导致骨强度降低,骨组织脆性增加,并且容易诱发骨折的慢性全身性骨骼系统疾病。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一种有再生能力的多向分化细胞,其在骨质疏松症发生、发展中发挥重要作用。MSCs发生衰老后,其成骨分化能力减弱、成脂分化增强,引起骨基质合成不足、脂肪组织增加,导致骨量减少、骨纤维结构异常,进而出现骨质疏松。晚期氧化蛋白产物（Advanced oxidation protein products,AOPPs）是蛋白质侧链氨基酸遭受氧化损伤后的交联物,是一种良好的氧化应激标志物。AOPPs作为一类致病介质,可通过活性氧（Reactive oxygen species,ROS）累积机制影响MSCs衰老,从而导致骨质疏松症的发生。目的本研究拟探讨AOPPs促进MSCs衰老的作用及其对成骨/成脂分化的影响。方法本研究使用原代培养的小鼠骨髓MSCs为体外模型,12周龄C57BL/6体内动物模型,拟研究:（1）CCK-8检测AOPPs对MSCs增殖能力的影响（2）qPCR检测AOPPs刺激MSCs成脂和成骨相关基因表达变化（3）Western blot检测药物刺激后,NADPH氧化酶来源途径及线粒体途径的相关蛋白表达（4）β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞数量（5）DCFH-DA探针检测细胞内总ROS生成（6）茜素红染色和油红O染色评价药物刺激后成骨及成脂表达（7）免疫印迹检测衰老相关指标H3K9Me2和γ-H2AX蛋白表达结果***诱导MSCs衰老及其对成骨/成脂分化的影响AOPPs刺激MSCs,衰老细胞数量明显增多,细胞衰老相关因子（H3K9Me2和γ-H2AX）表达上调;AOPPs减弱MSCs的成骨分化能力,并且增强其成脂分化能力。***诱导ROS累积的相关分子机制（1）AOPPs干预可增加MSCs胞内ROS水平（2）AOPPs通过NADPH氧化酶途径和线粒体途径促进ROS生成（3）AOPPs作用MSCs后,可引起抗氧化系统激活,抗氧化相关蛋白表达量增加（4）清除ROS,可降低衰老相关蛋白表达,使成骨分化能力增强,成脂分化能力减弱结论AOPPs可通过诱导ROS累积,促进MSCs衰老,降低成骨分化,增加成脂分化。

关键词：晚期氧化蛋白产物骨髓间充质干细胞活性氧

晚期氧化蛋白产物对老年大鼠骨代谢影响的实验研究

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晚期氧化蛋白产物对老年大鼠骨代谢影响的实验研究

作者：曾纪焕南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种以骨密度降低、骨组织微结构退化为特征、导致骨骼脆性增加而易引发骨折的全身性骨代谢疾病,主要表现为腰背部疼痛、身长缩短、骨折、驼背、呼吸功能受限以及骨密度下降等。OP发病率高... 详细信息

研究背景骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种以骨密度降低、骨组织微结构退化为特征、导致骨骼脆性增加而易引发骨折的全身性骨代谢疾病,主要表现为腰背部疼痛、身长缩短、骨折、驼背、呼吸功能受限以及骨密度下降等。OP发病率高,病程长,可不同程度影响患者生活质量,特别是由其引发的各类骨质疏松性骨折,常给患者带来致命性灾难。OP是目前影响人类健康的主要疾病之一,同时给社会造成了巨大的经济负担,已成为重要的公共健康问题。老年性骨质疏松症（Senile Osteoporosis,SOP）又称为Ⅱ型骨质疏松症,是原发性骨质疏松症的重要类型。随着人均寿命的延长特别是近年来人口老龄化进程的不断加剧,SOP患者人数在整个骨质疏松症人群中所占的比例不断上升,使得近年来各类骨质疏松性骨折的发生率明显升高。据统计,即使保持年龄因素对引发髋部骨折结局的影响强度不变,世界范围内发生髋部骨折的人数将从1990年的170万上升至2050年的630万。因此,如何有效应对SOP在整个OP的防控工作中具有越来越重要的意义。近几十年来国内外在妇女绝经后骨质疏松症（Postmenopausal Osteoporosis,PMO）方面进行了大量深入细致的研究工作,取得了可喜成绩。而相比之下,对SOP的研究却未得到足够重视。目前,针对SOP的治疗方法很多,但其有效性及安全性噬待提高。因此,研究SOP的发生发展机制、探索防治SOP的新途径,具有极其重要的社会意义。人体内氧化还原反应失衡导致活性氧类物质（Reactive Oxygen Species, ROS）积聚,引发氧化应激。在氧化应激状态下,大分子结构物质如蛋白质、脂质、DNA/RNA等易遭受氧化损伤而丧失正产的结构和功能,其中蛋白质是氧化损伤的主要原初靶。晚期氧化蛋白产物（Advanced Oxidation Protein Products, AOPPs）就是体内蛋白质特别是白蛋白在氧化应激状态下经氧化修饰生成的一类双酪氨酸蛋白交联物,最早由Witko-Sarsat等在行血液透析的尿毒症患者血浆中发现。AOPPs也可在体外通过血浆或纯化的血清白蛋白与次氯酸混合反应而生成,其生成浓度与加入的次氯酸呈剂量依赖性关系。双酪氨酸是蛋白质被氧化后的的特征性结构,Horie等发现人体血浆中AOPPs浓度与双酪氨酸及蛋白质糖基化标志物戊糖苷浓度呈正比,因此,AOPPs是氧化应激的良好标志物。近十几年的研究发现,除尿毒症外,AOPPs的蓄积与人类多种疾病有关。Piwowar等发现2型糖尿病患者血浆AOPPs浓度明显较正常人高,并与体内氧化及抗氧化标记物浓度呈相关性,而有微血管病变的糖尿病患者血浆AOPPs浓度也明显高于无病变患者。慢性肾脏疾病（Chronic Kidney Disease, CKD）患者早期血浆AOPPs即显著升高,并随着肾功能恶化而进行性升高。AOPPs与动脉粥样硬化关系密切。Witko-Sarsat等对血液透析患者的研究发现该类患者血浆AOPPs浓度与颈动脉内膜中层厚度呈明显的相关性。Kaneda等针对冠心病人群进行的一项研究发现,冠心病患者血液中AOPPs浓度明显较正常人高,并与冠心病的严重程度相关,是冠心病的一个独立危险因素。Barsotti等还发现冠心病病人血浆AOPPs/巯基比例明显升高,并认为AOPPs/巯基比例升高可作为急性冠脉综合征发作的标志。既往文献报道的存在AOPPs蓄积的疾病还有IgA肾病、过敏性紫癜、过敏性鼻炎、慢性炎症性肠病、肥胖、非酒精性脂肪肝、急性消化性溃疡等。体内研究方面,AOPPs能增加糖尿病大鼠肾脏组织单核细胞浸润及单核细胞趋化因子（Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1）、转化生长因子（Transforming GrowthFactor-β,TGF-β）等促炎细胞因子的合成与释放,加速肾单位结构破坏,导致尿蛋白排出量增加,血肌酐升高;用AOPPs干预5/6肾切大鼠模型,也观察到了类似现象,同时还能使残肾的纤维化明显加快。AOPPs能促进正常新西兰白兔大动脉壁产生细胞炎症和脂滴沉积,加速高脂血症家兔动脉粥样斑块的形成。无论是糖尿病大鼠模型、5/6肾切模型还是正常新西兰白兔,AOPPs干预下相应组织中ROS均明显升高。体外研究方面,Witko-Sarsat等发现AOPPs能激活单核细胞,诱导呼吸链爆发,产生氧化应激。Guo等证实从慢性肾衰和糖尿病患者体内分离、纯化的AOPPs以及体外制备的AOPPs均可通过细胞表面的晚期糖基化产物受体（（?）Receptor of Advanced Glycation End Products, RAGE）介导的、ROS敏感的MAPK和NF-κB信号通路激活人血管内皮细胞。AOPPs也能通

关键词：老年性骨质疏松晚期氧化蛋白产物氧化应激活性氧类物质骨退化

晚期氧化蛋白产物对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响

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晚期氧化蛋白产物对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响

作者：李忠海第一军医大学

学位级别：硕士

一、背景动脉粥样硬化(AS)是慢性肾衰(CRF)病人常见的心血管并发症，CRF时AS的发病率较同龄一般人群明显增高，且发病年龄提前至30—40岁，故被称为“加速型动脉粥样硬化”(AAS)，其发病机制目前还不完全清楚。已有研究证实，血液... 详细信息

一、背景动脉粥样硬化(AS)是慢性肾衰(CRF)病人常见的心血管并发症，CRF时AS的发病率较同龄一般人群明显增高，且发病年龄提前至30—40岁，故被称为“加速型动脉粥样硬化”(AAS)，其发病机制目前还不完全清楚。已有研究证实，血液透析过程中，血细胞接触生物相容性欠佳的透析膜或透析液中污染的内毒素可激活循环中性粒细胞和单核细胞，产生大量的活性氧(ROS)。ROS可氧化修饰低密度脂蛋白(LDL)产生氧化型低密度脂蛋白(Ox—LDL)，后者是导致AS的重要因素。近年大量文献证实，透析前的轻—中度肾功能减退的病人体内ROS水平已明显升高。研究表明，体内蓄积的某些尿毒症毒素可能与CRF病人的氧化应激有关，晚期氧化蛋白产物(AOPP)就是近年引起重视的这类大分子毒素之一。1996年Witko-Sarsat等发现CRF病人血浆中AOPP水平明显增高，主要存在于白蛋白中，特征是酸性条件下在340nm有特异吸收峰。在体外用次氯酸(HOCl)与白蛋白作用可得到与CRF病人血浆中相似的AOPP。已证实，轻—中度肾功能减退的病人循环AOPP水平已明显增高，且随肾功能恶化进行性增加，被认为是一种反映CRF时氧化应激的新的标志物。中性粒细胞活化时髓过氧化物酶(MPO)催化产生的HOCl可能修饰血浆蛋白而生成过量AOPP。体外研究发现，AOPP可引起中性粒细胞和单核细胞的呼吸爆发，提示AOPP可能是一种具有促炎症活性的尿毒症毒素。最近研究发现AOPP可能与动

关键词：晚期氧化蛋白产物一氧化氮一氧化氮合酶巨噬细胞动脉粥样硬化氧化应激

晚期氧化蛋白产物诱导小肠上皮细胞钙转运通道表达减少的作用及其机制

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晚期氧化蛋白产物诱导小肠上皮细胞钙转运通道表达减少的作用及其...

作者：吴佩群南方医科大学

学位级别：硕士

背景和目的：晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)在1996年首次由Wtko-Sarsat等人在长期透析的尿毒症患者的血浆中发现,是氧化蛋白化合物的新成员。它是一种由血浆蛋白和氯化氧化剂如次氯酸(HC10)反应后含双... 详细信息

背景和目的：晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)在1996年首次由Wtko-Sarsat等人在长期透析的尿毒症患者的血浆中发现,是氧化蛋白化合物的新成员。它是一种由血浆蛋白和氯化氧化剂如次氯酸(HC10)反应后含双酪氨酸的蛋白交联物,在吸光度为340nm时有两个特定的可视吸收峰,对应的分子量分别是60KDa和600KDa。在体外,用HC10作用于纯化的血清白蛋白或血浆可得到与尿毒症患者血浆中类似的AOPPs。目前,AOPPs己被认为是氧化应激过程(Oxidative stress,OS)中蛋白质的最终氧化产物,是一种良好的氧化损伤的敏感标志物。研究表明,AOPP相对OS其他标志物如晚期糖化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)、晚期脂质过氧化终末产物(advanced lipoperoxidation end products,ALEs),是更敏感的OS指标,且更能反映急性OS过程。AOPPs不仅是氧化损伤的新型标志物,其本身更是一种炎性介质,参与人类多种疾病的发生与发展。AOPPs可以在体内外刺激中性粒细胞及单核细胞的呼吸爆发,促进合成、释放大量促炎性细胞因子,如白细胞介素(IL)1、TNF-α等,诱发全身微炎症反应。TNF-α不但可通过诱导细胞凋亡参与急性肝衰竭的发病过程,还可以通过多种途径介导肝细胞的损伤。AOPPs还可以诱导人内皮细胞炎症反应,进而促进糖尿病、慢性肾衰竭及动脉粥样硬化的发生与发展。研究证实,炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)患者血清的AOPPs水平较健康人的显著增高,且在克罗恩病(Crohn’s disease,CD)患者中AOPPs水平与疾病活动有关。骨质疏松(Osteoporosis,OP)是一种以骨量下降和骨组织的微细结构破坏为特征的系统性骨病。在上个世纪70年代已有文献报道,IBD患者容易出现骨质疏松,继而骨折的发生率增加。Almenier等提出OS(氧化／抗氧化系统的失衡)与IBD的发展及其并发OP密切相关,但具体致病机制尚不明确。研究报道AOPPs的累积是IBD患者体内OS过程中新型的氧化标志物,但它在IBD患者中并发OP的病理机制仍不清楚。小肠钙离子吸收的减少是导致骨量丢失甚至OP发生的重要原因之一。钙离子吸收的主要部位发生在近端小肠(十二指肠和近端空肠),而钙离子吸收的方式主要分为跨细胞膜被动吸收与跨细胞膜主动转运,通常认为主动转运途径是近端小肠钙离子吸收的主要方式。主动转运主要由以下三步完成：(1)小肠上皮顶端刷状缘膜上瞬时受体电位香草酸受体(transient receptor potential vanilloid,TRPV) 5/6、电压依赖性L型钙通道(voltage-dependent L-type calcium channel, CaV1.3)的开放吸收钙离子进入细胞内;(2)胞浆内钙结合蛋白(calcium binding protein, CaBP-D9k)结合钙离子并运输至细胞基底侧;(3)细胞质膜钙ATP酶(plasma membrane calcium ATPase, PMCA1)和浆膜侧钠钙交换器(sodium calcium exchanger1,NCX1)。同时,血清钙离子的平衡受相关激素如甲状旁腺素(Parathyroid hormone, PTH)、25-羟基维生素D3 [25-(OH)D3]和1,25-二羟基维生素D3 [1,25-(OH)2D3]的调节。AOPPs血清水平在IBD患者中显著增高,但它在IBD并发OP的病理学机制尚不明确,是否通过下调小肠上皮钙转运通道(Calcium transport channels, CTCs)的表达而减少血清钙离子浓度,从而引起OP?是否影响PTH、25-(OH)D3和1,25-(OH)2D3的分泌而调节钙离子平衡,引起骨量的丢失?因此,本研究完成以下三个目标：(1)证实AOPPs对小肠上皮钙转运通道表达的调控作用;(2)探讨AOPPs对血清钙离子及其相关调节激素的作用;(3)明确AOPPs作用的机制。材料和方法：1.无内毒素AOPPs的制备与测定。按照Witko-Sarsat等介绍的方法,在体外将20 mg/mL的无内毒素大鼠白蛋白(RSA)与40 mmol/L的次氯酸(HC10)等体积混合,混匀后在室温孵育30min,即制备出RSA:HClO摩尔比为1：140的AOPPs。制备的AOPPs用无内毒素的磷酸盐缓冲液(PBS)在4℃下连续透析24 h,以去除游离的HClO。再用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,并放在-200C保存。20mg/mL RSA与PB

关键词：晚期氧化蛋白产物钙离子钙转运通道小肠上皮 MAPK

晚期氧化蛋白产物诱导人肾小球内皮细胞发生间充质转分化的机制研究

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晚期氧化蛋白产物诱导人肾小球内皮细胞发生间充质转分化的机制研...

作者：梁秀洁南方医科大学

学位级别：硕士

[研究背景]糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是全球范围内引起终末期肾病的首要原因。蛋白尿是DN的主要临床特征,也是促进DN进展的独立危险因素,可由肾小球滤过屏障损害所致。肾小球内皮细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,在调... 详细信息

[研究背景]糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是全球范围内引起终末期肾病的首要原因。蛋白尿是DN的主要临床特征,也是促进DN进展的独立危险因素,可由肾小球滤过屏障损害所致。肾小球内皮细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,在调节肾小球滤过率中发挥着重要的作用。肾小球内皮细胞损伤可导致肾小球滤过功能的功能失调,进而导致蛋白尿的发生。此外,近年来,越来越多研究提示肾小球内皮细胞功能失调可促DN的进展。值得注意的是,内皮细胞间充质转分化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT/EndoMT),本质上可视为上皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的一种特殊类型,在内皮细胞损伤过程及肾小球硬化和肾小管间质纤维化的发生发展中起着重要的作用,而肾脏纤维化是DN的主要病理特征。EndMT发生时,内皮细胞失去其特异性标志物,如血小板内皮细胞粘附分子-1/CD31(plateletendothelial cell adhesion molecule/cluster of differentiation 31 PECAM-1/CD31)、血管内皮细胞钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)、 claudin5等,而重新获得间充质细胞特异性标志物,如成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast specific protein-1, FSP-1)、波形蛋白(vimentin)、和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等。 EndMT这个概念最先出现在胚胎心脏发育中,但近年来越来越多的研究显示EndMT在多种肾脏疾病中的肾纤维化过程中起着重要的作用。Zeisberg等学者利用三种不同的小鼠肾病模型(包括链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病模型),最先报道肾脏纤维化中肌成纤维细胞细胞可能来源于EndMT,而肌成纤维细胞在肾脏纤维化中发挥重要作用。随后,Li等学者研究证明了EndMT可促进早期DN的肾脏纤维化的发生及发展过程。综上,EndMT可促进DN肾脏纤维化的进展。因此,探讨诱导EndMT发生的机制可能为DN的防治提供新的干预靶点。然而,目前关于EndMT发生的机制仍知之甚少。多种因素可导致内皮细胞损伤。最近研究提示,晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products, AOPPs)可通过激活晚期糖基化终产物受体(receptor of advanced glycation end products, RAGE)介导的信号通路激活血管内皮细胞。AOPPs是由Witko-Sarsat等学者于1996年首次在慢性肾衰患者血浆中发现的一类尿毒症毒素,其主要成分是血清白蛋白酪氨酸残基氧化后形成的蛋白交联产物。近年来,越来越多的研究证据表明AOPPs参与了多种肾脏疾病(包括DN)的发生发展的过程。我们课题组最近的研究也证明了AOPPs可诱导人近端肾小管上皮细胞肥大及发生EMT。但是,AOPPs是否可诱导EndMT的发生及其机制目前尚待阐明。内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress, ERS)在肾脏病理生理过程中发挥着重要作用。内质网应激是由多种因素(如：饥饿、缺氧、病毒感染等)引起的病理生理状态。内质网腔中未折叠或错误折叠的蛋白可导致内质网应激,进而引起未折叠蛋白反应(一种内质网的适应性过程)。然而,由过强或持久的内质网应激引起的未折叠蛋白反应也可诱发细胞凋亡途径。内质网应激可诱导肺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、及肾小管上皮细胞发生EMT。值得注意的是,研究表明内质网应激可导致肾小球内皮细胞损伤。但是,内质网应激在AOPPs诱导的肾小球内皮细胞损伤过程中的作用尚未明确。[目的]本研究以体外培养的人肾小球内皮细胞(human renal glomerular endothelial cells, HRGECs)为研究对象,首先,探讨AOPPs是否可诱导人肾小球内皮细胞EndMT的发生,然后,探讨AOPPs是否可诱导人肾小球内皮细胞内质网应激的发生,最后,探讨内质网应激是否介导了AOPPs诱导人肾小球内皮细胞EndMT的过程。[研究方法]1.无内毒素AOPPs修饰蛋白的制备和鉴定参考文献方法体外制备AOPPs-BSAo将经纯化后、无内毒素的100 mg/mLBSA与200 mmol/L次氧酸等体积混合后(不含碳水化合物、游离脂肪酸和脂质,以排除形成AGEs样结构),于室温放置30分钟后,即可制备出BSA与次氯酸摩尔比为1：140的AOPPs-BSA.,制备的AOPPs-BSA在无菌P

关键词：晚期氧化蛋白产物内质网应激肾小球内皮细胞内皮细胞间充质转分化

晚期氧化蛋白产物与慢性肾脏病Ⅴ期非透析患者心血管疾病的关系

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晚期氧化蛋白产物与慢性肾脏病Ⅴ期非透析患者心血管疾病的关系

作者：田洁天津医科大学

学位级别：硕士

研究背景心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是慢性肾脏病(chronic kidneydisease,CKD)的最常见并发症和首要死亡原因。慢性肾脏病患者的CVD主要表现为两类:一是动脉血管疾病,包括动脉粥样硬化和小动脉硬化;二是心肌疾病,包括左... 详细信息

研究背景心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是慢性肾脏病(chronic kidneydisease,CKD)的最常见并发症和首要死亡原因。慢性肾脏病患者的CVD主要表现为两类:一是动脉血管疾病,包括动脉粥样硬化和小动脉硬化;二是心肌疾病,包括左心室肥厚(LVH)和左心室扩张。传统致CVD的危险因素在CKD患者中也较为普遍,但不能满意解释CKD患者CVD如此高的发病率和死亡率,提示还存在一些其他非传统的危险因素。晚期氧化蛋白产物(advanced oxidationprotein products,AOPPs)是体内白蛋白与次氯酸氧化的产物,是氧化介导的蛋白质损伤的重要标志物。研究显示AOPPs除了可作为氧化应激的指标外,它在慢性肾衰患者病理生理及透析相关并发症的发生发展中起着重要作用,特别是其与尿毒症心血管疾病的关系更加引人注目。国内外关于这方面的研究不多,而且主要是从不同的角度探讨了AOPPs与动脉粥样硬化性心血管疾病的关系,而AOPPs与尿毒症性心肌病,特别是与左心室肥厚的关系还未见报道。本研究以CKDV期非透析患者为研究对象,通过测定此类患者血浆AOPPs水平、颈动脉粥样硬化指标及左心室肥厚的相关指标,以期探讨作为尿毒症毒素的血浆AOPPs在CKDV期非透析患者动脉粥样硬化及左心室肥厚的作用及相关影响因素。方法采用分光光度计法对50例CKDV期非透析患者(试验组)及31例健康志愿者(对照组)进行血浆AOPPs测定,试验组同时检测血清白蛋白(Alb)等生化指标。并使用美国菲利浦IE3型彩色多普勒超声诊断仪由专职超声医师作单盲操作检测颈动脉粥样硬化及左心室肥厚相关指标。所有计量资料均采用(?)±s表示,统计学处理采用SPSS10.0统计软件包,两组间连续变量的比较采用两独立样本t检验,非连续变量的比较采用χ检验。AOPPs与其它指标的相关分析采用Pearson法。多元回归通过逐步多元线性回归分析。以P＜0.05认为差异具有统计学意义。结果 1.试验组血浆AOPPs水平明显高于对照组(P=0.000)。试验组以是否原发病为糖尿病分为两组,两组间AOPPs水平无显著性差异(P=0.250)。 2.50例患者中有45例进行了颈动脉超声检查,其中31例(68.89%)存在颈动脉斑块,根据有无颈动脉粥样斑块进一步分组,两组间的AOPPs水平差异有统计学意义(P=0.025),相关分析显示,血浆AOPPs水平与颈总动脉IMT(r=0.593,P=0.000)及颈总动脉分叉部IMT(r=0.489,P=0.001)呈正相关,多元逐步回归分析,AOPPs(β=0.574,P=0.000;β=0.469,P=0.000)、年龄(β=0.485,P=0.000;β=0.545,P=0.000)是颈总动脉IMT及颈总动脉分叉部IMT的显著相关因素。 3.50例患者中有48例进行了心脏彩色多普勒超声检查,其中38例(79.17%)存在LVH。根据有无LVH将患者进一步分组,两组间的AOPPs水平差异有统计学意义(P=0.016),相关分析显示,血浆AOPPs水平与LVMI(r=0.355,P=0.013)呈正相关,多元逐步回归分析,AOPPs(β=0.336,P=0.015)、胆固醇(β=-0.291,P=0.033)是LVMI的显著相关因素。 4.50例患者中有34例(68%)既往发生CVD,将患者按有无CVD史进一步分组,比较发现有CVD史的患者血浆AOPPs水平显著升高[(22.29±9.20)比(16.89±3.40)μmol/L,P=0.029]。结论 1.慢性肾脏病V期非透析患者普遍存在高AOPPs血症,与原发病是否为糖尿病无关。 2.慢性肾脏病V期非透析患者普遍存在动脉粥样硬化,AOPPs可能参与慢性肾脏病V期非透析患者动脉粥样硬化的发生和发展。 3.慢性肾脏病V期非透析患者普遍存在左心室肥厚,AOPPs可能参与慢性肾脏病V期非透析患者左心室肥厚的发生和发展。

关键词：晚期氧化蛋白产物慢性肾脏病动脉粥样硬化左心室肥厚心血管疾病