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独立成分方法分析蛋白酶体靶蛋白酶切位点的特异性

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独立成分方法分析蛋白酶体靶蛋白酶切位点的特异性

作者：刘宁大连理工大学

学位级别：硕士

我们的人类身体不断地受到数十亿潜在病原体的威胁,例如细菌,病毒,真菌和寄生虫。因此,多层防御已经演变成通过复杂的机制来保护人类身体免受这些病原体的侵害。物理和化学屏障,如皮肤或胃液,是防止病原体进入宿主生物体的主要非特异性... 详细信息

我们的人类身体不断地受到数十亿潜在病原体的威胁,例如细菌,病毒,真菌和寄生虫。因此,多层防御已经演变成通过复杂的机制来保护人类身体免受这些病原体的侵害。物理和化学屏障,如皮肤或胃液,是防止病原体进入宿主生物体的主要非特异性防护屏障。CD8+T淋巴细胞是特异性免疫细胞,它介导了对肿瘤的有效免疫反应,CD8+T细胞能识别清除病毒细胞。细胞表面表达的主要组织相容性复合体,MHC I(major histocompatibility complex)分子向外界传递抗原多肽,使其能够被细胞毒性T淋巴细胞CTLs(cytotoxic T cell)特异性识别。这些特殊的T细胞可以检测到其他细胞,这些细胞内能表达外来或异常(即突变的)蛋白分子,并随后从体内清除这些多余的细胞。这些抗原肽需要26s蛋白酶体降解抗原蛋白,形成抗原肽的大小要适合运输,它们由抗原相关转运体TAP(transporter associated with antigen processing)分子运输至内质网ER(endoplasmic reticulum),和MHC I类分子的结合槽对接。T细胞在免疫过程中,主要是通过其表面受体TCR(T cell receptor)对抗原肽的识别启动免疫反应。在本文研究中,从相应资源的数据库找到相关抗原肽对应的源蛋白,构成蛋白酶体裂解位点正负样本实验数据,采用负熵的FastICA方法建立蛋白酶体裂解位点预测模型,预测准确度为70.86%。将本文建立的预测模型和文献的其它模型在相同的数据下进行对比分析,本文的预测模型结果更佳。另外,通过对蛋白酶体结构分析可知,蛋白酶体对抗原蛋白裂解位点是有选择的,并对裂解位点的特异性进行分析讨论。

关键词：蛋白酶体酶切位点独立成分分析抗原肽牛顿迭代法

携带特定HLA-DR基因的B淋巴母细胞系呈递HBV多肽的质谱分析

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携带特定HLA-DR基因的B淋巴母细胞系呈递HBV多肽的质谱分析

作者：汝佳秋哈尔滨医科大学

学位级别：硕士

背景及目的:HBV感染呈世界性分布,是严重危害人类健康的重大传染病。国内外研究表明,HLAⅡ分子呈递的抗原肽在诱导机体特异性淋巴细胞反应过程中可有效清除感染病毒,但在乙肝慢性化过程中的确切作用尚不完全清楚。本课题组前期在对急、... 详细信息

背景及目的:HBV感染呈世界性分布,是严重危害人类健康的重大传染病。国内外研究表明,HLAⅡ分子呈递的抗原肽在诱导机体特异性淋巴细胞反应过程中可有效清除感染病毒,但在乙肝慢性化过程中的确切作用尚不完全清楚。本课题组前期在对急、慢性和自限性HBV感染人群的流行病学观察发现,黑龙江地区HBV感染人群以HBV C2亚型为主,且乙肝的慢性化转归与HLA-DR12等位基因频率呈正相关。在特异性实验肽诱导的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）增殖和HLA-DR抗体阻抑实验中发现,与具有保护性作用的HLA-DR13分子相比,HLA-DR12分子呈递的HBV抗原肽谱广泛但特异性较低。提示具有HLA-DR遗传背景的群体感染HBV的临床转归可能是HLA-DR分子结合的HBV抗原肽谱具有偏好性,进而激发出CD4T细胞不同极化方向来实现的。本课题旨在通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）联合质谱分析（mass spectrometry,MS）和免疫生物信息学方法对与HBV感染转归相关的HLA-DR分子所能呈递的HBV特异性抗原肽特征进行初步探讨。方法:EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）转化HBV疫苗免疫的健康人PBMCs,以构建携带特定HLAⅠ类和Ⅱ类分子的BLCLs,流式细胞术检测其CD19阳性率,PCR-直接测序法（PCR-sequence based typing,PCR-SBT）分别对各株细胞HLA-A/B/C和HLA-DP/DQ/DR进行分型。将p AAV/HBV1.2质粒瞬时转染BLCLs 18、24和48小时,分别采用q RT-PCR和ELISA法检测培养上清中HBV DNA载量、HBs Ag和HBe Ag水平;q RT-PCR法检测各株细胞HLA-DR m RNA相对表达量的水平。对转染重组质粒48小时的BLCLs进行Co-IP以富集多肽/HLA复合物（peptide-HLA complex,p HLA）,WB法检测HLA-DR水平,LC-MS/MS对多肽-HLA复合物进行测序,实验结果做软件比对和统计学分析。结果:1.构建了五株携带特定HLA-DR分子的BLCLs,各株细胞表面CD19均呈高表达（85.5～96.4%）。依照其HLA-DRB1等位基因进行命名,分别为HLA-DR12/12、HLA-DR07/12、HLA-DR09/09、HLA-DR14/15和HLA-DR13/15。2.转染18、24和48小时的培养上清液中,HBV DNA载量随时间逐渐下降;HBs Ag水平在HLA-DR12/12和HLA-DR14/15株于转染48小时显著高于转染24小时（P抗原肽,共计36条;Net MHCⅡpan-4.0算法预测到2个强结合力p HLA和10个弱结合力p HLA。同时,获取的多肽谱与报道肽进行HLA分子限制性HBV抗原肽序列匹配,其中,25条多肽以共同、重叠或包含序列的方式被报道,且有13条与相应细胞系所携带的等位基因一致。结论:1.构建了五株BLCLs,依次命名为HLA-DR12/12、HLA-DR07/12、HLA-DR09/09、HLA-DR14/15和HLA-DR13/15。2.五株细胞初步共筛选出36条HLA-DR限制性HBV抗原肽,可能发现了23条特定HLA-DR限制的新抗原肽。

关键词： BLCLs HLA-DR HBV 抗原肽 LC-MS/MS

绵羊MHC Ⅱ DRB1基因酵母表面展示库的构建及布鲁氏菌M5株抗原表位的筛选

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绵羊MHC Ⅱ DRB1基因酵母表面展示库的构建及布鲁氏菌M5株抗原表...

作者：王元元石河子大学

学位级别：硕士

目的:对布鲁氏菌检测阳性及阴性的哈萨克羊个体的DRB1基因外显子3利用PCR-SSCP技术,进行多态性检测,获得多态位点;构建酿酒酵母表面展示重组表达载体pYD1-DRB1;对绵羊DRB1基因外显子2两端进行点突变,引入特定酶切位点;构建绵羊DRB1基因... 详细信息

目的:对布鲁氏菌检测阳性及阴性的哈萨克羊个体的DRB1基因外显子3利用PCR-SSCP技术,进行多态性检测,获得多态位点;构建酿酒酵母表面展示重组表达载体pYD1-DRB1;对绵羊DRB1基因外显子2两端进行点突变,引入特定酶切位点;构建绵羊DRB1基因酵母多态表面展示库;检测DRB1基因在酵母细胞表面的表达;用布鲁氏菌pmc221-GFP-M5免疫小鼠,检测外周血白细胞是否发光;探索初步构建布鲁氏菌抗原肽库的可行途径。为绵羊的育种及布鲁氏菌病的防治机理奠定基础,并提供一定的理论依据。方法:1、用虎红平板试剂盒对180只哈萨克羊样本进行布鲁氏菌检测,利用PCR-SSCP结合直接测序的方法,对哈萨克羊MHC-DRB1基因外显子3的多态位点进行检测。2、通过定点突变,在DRB1基因外显子2两端插入限制性酶切位点,构建绵羊DRB1基因酵母多态展示库,半乳糖诱导,通过细胞免疫荧光检测目的蛋白的表达。3、用布鲁氏菌pmc221-GFP-M5侵染小鼠,通过密度梯度离心分离外周血白细胞,激光共聚焦观察白细胞是否有绿色荧光。结果:1、利用虎红平板检测哈萨克羊布鲁氏菌感染率,在180只哈萨克羊中检测出146只阴性样本,34只阳性样本,阳性检出率为18.89%。2、利用PCR-SSCP技术结合直接测序的方法对哈萨克羊DRB1基因外显子3进行多态性检测,结果发现哈萨克羊DRB1基因外显子3中存在7个多态位点,分别是:T10C、C119T、G215C、A238G、T245G、G256A和C259T,且这些多态位点与哈萨克羊布鲁氏菌病的易感性无相关性。3、通过点突变成功引入了特定的酶切位点,构建绵羊DRB1基因酵母多态表面展示库,经半乳糖诱导表达,细胞免疫荧光检测,结果显示:绵羊DRB1基因在酵母表面成功表达并具有正确的空间构象。4、利用激光共聚焦观察密度梯度离心得到的白细胞,视野里有绿色荧光出现。结论:1、通过对哈萨克羊MHC-DRB1基因的外显子3序列的多态性进行检测,结果表明:哈萨克羊DRB1基因外显子3序列具有较低的多态性。2、成功构建了绵羊DRB1基因酵母多态展示库,半乳糖诱导后,在激光共聚焦下有绿色荧光出现,表明:DRB1蛋白在酵母细胞表面表达成功。说明此种方法可以适用于绵羊MHCⅡ类基因的真核表达。3、通过密度梯度离心,激光共聚焦下观察,检测到白细胞中有绿色荧光出现。说明pmc221-GFP-M5布鲁氏菌能成功侵入白细胞中,并使其发光。

关键词： OLA-DRB1 PCR-SSCP 点突变酵母表面展示抗原肽

TCR-peptide-MHCI类蛋白质复合体相互作用QM/MM分子动力学模拟研究

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TCR-peptide-MHCI类蛋白质复合体相互作用QM/MM分子动力学模拟研究

作者：隋文鹏大连理工大学

学位级别：硕士

特异性T细胞免疫是人体免疫系统的重要功能之一,T细胞表位是激活这一免疫应答的关键因素。T细胞表位是指抗原分子内部的一条抗原短肽,它不能直接被T细胞受体识别,需要先经过一系列的加工才能与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合成为MH... 详细信息

特异性T细胞免疫是人体免疫系统的重要功能之一,T细胞表位是激活这一免疫应答的关键因素。T细胞表位是指抗原分子内部的一条抗原短肽,它不能直接被T细胞受体识别,需要先经过一系列的加工才能与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合成为MHC分子-抗原短肽复合物。复合物随后被转移到抗原递呈细胞表面与T细胞表面受体结合,从而激活免疫应答。本文采用TCR-TAX-HLA-A*0201蛋白质晶体结构作为模拟体系,利用QM/MM方法进行分子动力学模拟,在每个口袋分别用19种剩余的氨基酸替换天然抗原肽的锚定氨基酸,将模拟得到的口袋氨基酸的极化电荷表示为电多极矩,从而表示出极化电荷产生的静电势变化,运用箱线图的分析方法确定各个口袋氨基酸的功能。通过分析可以得到,MHC中的Pocket 2中Lys66和Glu63既是精细识别氨基酸,也是高级结合氨基酸;Pocket 9中Asp77和Tyr84是精细识别氨基酸,而Lys146和Asp77是高级结合氨基酸。以上结果说明这两个口袋基本确定了MHC分子对抗原肽的结合特异性。TCR中口袋氨基酸的静电势变化量普遍大于MHC中口袋氨基酸的值,这表明TCR分子在免疫特异性识别和结合方面起主要作用,并且Pocket 5中含有一个既是精细识别氨基酸又是高级结合氨基酸的Arg590,这说明Pocket 5是TCR中比较重要的口袋。本文证实利用QM/MM分子动力学模拟来分析蛋白质的特异性识别是一种可行的方法。

关键词： TCR分子抗原肽 MHC Ⅰ类复合体 QM/MM方法电多极矩箱线图

蚯蚓纤溶酶组分抗原性、体内代谢及原位定位的分析

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蚯蚓纤溶酶组分抗原性、体内代谢及原位定位的分析

作者：侯艳河北大学

学位级别：硕士

蚯蚓纤溶酶是从不同种属的蚯蚓中均可分离到的一种多组分的纤维蛋白水解酶,具有直接纤溶活性和纤溶酶原激活活性,既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成,实验表明该酶具有抗凝、溶纤、改善血液流变学性质,可以口服,而且稳定性好、纤溶活... 详细信息

蚯蚓纤溶酶是从不同种属的蚯蚓中均可分离到的一种多组分的纤维蛋白水解酶,具有直接纤溶活性和纤溶酶原激活活性,既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成,实验表明该酶具有抗凝、溶纤、改善血液流变学性质,可以口服,而且稳定性好、纤溶活性强、药理作用广泛、副作用小,目前已广泛用于临床,是预防和治疗血栓疾病的有效药物。本文就蚯蚓纤溶酶组分的抗原性、体内代谢及其在赤子爱胜蚓体内的原位定位进行了研究,为其生物化学、细胞生物学以及临床应用方面的深入研究提供参考资料。主要从以下几个方面进行了研究：1.以热变性蚯蚓纤溶酶组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1,以及重组蛋白EfP-Ⅲ-2为抗原免疫家兔获得了抗血清,利用获得的抗血清对部分组分的免疫学同一性进行了验证。EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ的免疫双扩散反应表明EfP-Ⅰ和EfP-Ⅱ具有部分免疫学同一性。利用DNAMAN软件对获得的EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ、EfP-Ⅳ的蛋白质序列进行了初步分析,包括整个序列相似性比对、氨基酸组成、蛋白酶消化、抗原肽、疏水性和亲水性轮廓等,并对N端氨基酸序列进行了分析,结果表明EfP-Ⅰ和EfP-Ⅱ具有部分免疫学同一性是由它们蛋白质序列的组成和结构决定的。2.利用获得的蚯蚓纤溶酶组分的特异性抗体作探针和高度灵敏的ELISA来研究蚯蚓纤溶酶组分在消化道内的吸收率和半衰期。由于蚯蚓纤溶酶的最适PH值近中性,而胃液的酸性较强,所以小鼠口服水溶性蚯蚓纤溶酶组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1和EFE,在胃液中会有一定的损失,血清中含量极低,只有180min检测到有少量蚯蚓纤溶酶存在。与口服相比静脉注射在生物体内的利用率相对较高,小鼠静脉注射蚯蚓纤溶酶组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1和EFE,随着时间的延长,它们在体内的含量逐渐下降,但是单一组分比混合组分在体内具有更长的半衰期,如果能将蚯蚓纤溶酶单一组分的纯品制成静脉注射用的针剂,那么就可以用来治疗一些急性血栓病。3.利用光镜免疫组织化学技术,结合制备和保存的多克隆抗血清,对蚯蚓纤溶酶组分在赤子爱胜蚓体内的原位定位,进行了初步的探索。结果发现,蚯蚓纤溶酶组分定位和表达在围绕生殖环的消化道上皮细胞,除了口部和后肠之外,位于前部的消化区域具有较高的酶活性。这个区域包括嗉囊、砂囊、胃和前部的肠,是重要的储存和消化食物的器官。EfP-0主要分布在嗉囊、砂囊和前部的肠;EfP-Ⅰ是蚯蚓体内含量最多的组分,主要分布在嗉囊、砂囊、胃和前部的肠;EfP-Ⅱ主要分布在嗉囊和砂囊;EfP-Ⅲ主要分布在嗉囊、砂囊和胃肠连接处。由于EfP-Ⅱ具有广泛的底物特异性,所以它主要位于消化道的前部,对食物进行初步消化。EfP-Ⅲ的高活性和高稳定性负责对从胃进入小肠的食物进行彻底的分解,以便小肠吸收。EfP-0和EfP-Ⅰ协助EfP-Ⅱ和EfP-Ⅲ完成整个消化过程。

关键词：蚯蚓纤溶酶抗原性免疫学同一性抗原肽免疫组织化学

肿瘤免疫治疗的新靶抗原——NY-ESO-1

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中国组织化学与细胞化学杂志 2003年第2期12卷 214-217页

作者：范蓉罗昱谢小薰广西医科大学组织学与胚胎学教研室南宁530021

NY ESO 1为CTA家族中的一种 ,是目前免疫原性最强的肿瘤抗原之一 ,有望成为用于肿瘤免疫治疗的新靶疫苗。本文就其基因与蛋白、表达与机理、抗原肽及免疫治疗等作一综述。

关键词：肿瘤免疫治疗新靶抗原抗原肽

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支持向量机预测TAP分子的结合肽

支持向量机预测TAP分子的结合肽

作者：常世勇大连理工大学

学位级别：硕士

特异性免疫中抗原的类别有外源性和内源性之分,外源性抗原是指由其它细胞(如细菌、真菌)产生被专职性抗原提呈细胞摄入的抗原。内源性抗原主要是指在非专职性抗原提呈细胞(如病毒感染细胞、肿瘤细胞)内部合成的抗原。内源性抗原在细胞... 详细信息

特异性免疫中抗原的类别有外源性和内源性之分,外源性抗原是指由其它细胞(如细菌、真菌)产生被专职性抗原提呈细胞摄入的抗原。内源性抗原主要是指在非专职性抗原提呈细胞(如病毒感染细胞、肿瘤细胞)内部合成的抗原。内源性抗原在细胞液中被蛋白酶体分解为不同长度的短肽,镶嵌在内质网膜上的跨膜转运蛋白(TAP)可以选择性的结合部分短肽,并且在ATP供能下把抗原肽由细胞液转运至内质网腔,在质网腔中与新组装的MHC-I类分子结合,二者聚合物经过高尔基体运送到细胞膜上,被CD8+T细胞识别。本文的主要工作是用支持向量回归机(SVR)算法预测抗原肽与TAP分子的结合力,向量机的训练集是和TAP分子有已知亲和力的九肽的数据集(613个9肽),用决定系数R和均方根误差RMSE作为评估模型预测性能指标。结果表明,对肽结合到TAP分子影响最大的是C-末端(P9)位置上的氨基酸,其次是P1、P2和P3位置上的氨基酸。剩余的其它位置上的氨基酸对肽与TAP分子的结合也有一定的影响。

关键词： T细胞抗原加工抗原肽 TAP分子支持向量回归机

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MHCI类分子四聚体技术的应用研究进展

生命科学 2015年第2期27卷 228-233页

作者：董宋鹏李子彬杨杰高凤山大连大学生命科学与技术学院大连116622 吉林农业大学生命科学学院长春130118

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)I类分子四聚体(tetramer)技术可直接对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)进行标记,以检测能够识别特定抗原肽-MHC I的CTL,用于临床检测、疾病诊断... 详细信息

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)I类分子四聚体(tetramer)技术可直接对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)进行标记,以检测能够识别特定抗原肽-MHC I的CTL,用于临床检测、疾病诊断及相关科学研究。综述了MHC I四聚体技术应用的最新研究进展,为开展四聚体的相关研究提供新的参考。

关键词： MHC I 四聚体抗原肽细胞毒性T淋巴细胞

新型冠状病毒抗原表位及其特异性T细胞的筛选

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中国细胞生物学学报 2022年第7期44卷 1238-1247页

作者：戴春烨许雯珏刘凌峰复旦大学生命科学学院上海200438

该文利用MHC四聚体技术从接种新冠疫苗人群体内筛选出SARS-CoV-2特异性T细胞。该实验针对中国人群最为常见的HLA-A*0201分型,通过IEDB、SYFPEITHI和NetMHCpan4.0等生物信息学方法预测新冠病毒S蛋白抗原肽,并结合UV-置换抗原肽实验验证,... 详细信息

该文利用MHC四聚体技术从接种新冠疫苗人群体内筛选出SARS-CoV-2特异性T细胞。该实验针对中国人群最为常见的HLA-A*0201分型,通过IEDB、SYFPEITHI和NetMHCpan4.0等生物信息学方法预测新冠病毒S蛋白抗原肽,并结合UV-置换抗原肽实验验证,确定了7个9肽抗原肽,分别是S538、S976、S996、S1060、S1185、S1192和S1220,其中S1220的亲和性最高,S538的亲和性最低。接着利用MHC四聚体技术合成了除S538外的6种HLA-A*0201限制性S蛋白特异性四聚体,并在接种疫苗的HLA-A*0201人群PBMCs中筛出了其特异性的T细胞。这证明了接种新冠疫苗的HLA-A*0201人群体内的确存在针对SARS-CoV-2的细胞免疫反应,同时发现不同个体对SARS-CoV-2不同抗原肽免疫反应产生的特异性T细胞在数量和频率上存在差异性,为后续研究新冠疫苗引起的细胞免疫作了铺垫。

关键词： SARS-CoV-2 S蛋白抗原肽 MHC四聚体 T细胞