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横川后殖吸虫与扇棘单睾吸虫双重PCR鉴别方法的建立

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2015年第3期33卷 176-180页

作者：梅雪芳李树清康羊群石云良黄腾飞陈志飞黄维义广西大学动物科技学院南宁530004 上海出入境检验检疫局上海200135 广西大学食品安全研究中心南宁530004 罗氏诊断产品(上海)有限公司上海200335

目的建立一种能快速鉴定横川后殖吸虫(Metagonimus yokogawai)和扇棘单睾吸虫(Haplorchis taichui)的双重PCR方法。方法从Gen Bank中获取横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫以及与其同源性较高的虫种的核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列,应... 详细信息

目的建立一种能快速鉴定横川后殖吸虫(Metagonimus yokogawai)和扇棘单睾吸虫(Haplorchis taichui)的双重PCR方法。方法从Gen Bank中获取横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫以及与其同源性较高的虫种的核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列,应用Primer premier 5.0软件设计2对特异性引物,并优化PCR反应体系和反应条件,建立双重PCR法。将横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫与17个相关虫种一起进行PCR扩增,检测方法的特异性。横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫的ITS1扩增产物经p MD19-T载体进行TA克隆获得质粒,并将质粒进行梯度稀释,检测其敏感性。应用新建的双重PCR法鉴定从47副猫内脏和40副犬内脏中收集的吸虫,检测该方法的准确性和实用性。结果新建的双重PCR法能扩增出横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫的目的片段,大小分别为648 bp和279 bp,不与钩棘单睾吸虫、华支睾吸虫、心形咽口吸虫、次睾属吸虫囊蚴、外睾属吸虫囊蚴、藐小棘隙吸虫、抱茎棘隙吸虫、弗氏棘口吸虫、似锥低颈吸虫、全冠属吸虫、重盘属吸虫、异尖属线虫、东方次睾吸虫、卫氏并殖吸虫、瓦氏瓦生吸虫、背孔属吸虫和宫脂属线虫的DNA发生交叉扩增,具有较好的特异性。敏感性试验表明,应用该双重PCR法,2类吸虫DNA的最低检测值分别为1.49×10-1pg和1.14×10-1pg。对来自猫内脏和犬内脏的吸虫检测表明,该方法能够区分横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫,并且不与猫、狗中其他的吸虫DNA发生交叉扩增。结论本研究所建立的双重PCR法可用于快速鉴定横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫。

关键词：横川后殖吸虫扇棘单睾吸虫双重PCR 鉴别

基于线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1基因鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的双重PCR法的建立

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2018年第2期36卷 187-189页

作者：蒋智华杨庆利杨益超广西壮族自治区疾病预防控制中心、广西病毒性肝炎防治研究重点实验室南宁530028

分别提取华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的基因组DNA,针对两种吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1(COX1)基因设计引物,进行单重和双重PCR扩增。用针对华支睾吸虫的3对引物进行单重PCR扩增,FC1/RC1和FC3/RC3引物分别扩增出328 bp和356 bp的特... 详细信息

分别提取华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的基因组DNA,针对两种吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1(COX1)基因设计引物,进行单重和双重PCR扩增。用针对华支睾吸虫的3对引物进行单重PCR扩增,FC1/RC1和FC3/RC3引物分别扩增出328 bp和356 bp的特异性目的条带,而FC2/RC2引物未扩增出任何条带;用针对扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物进行单重PCR扩增,分别扩增出200 bp和190 bp的特异性目的条带。用华支睾吸虫FC1/RC1引物,结合扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物,分别进行双重PCR扩增,均能扩增出特异性条带,彼此间无干扰。

关键词：华支睾吸虫扇棘单睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1基因双重PCR

钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫ITS2序列测定及其种系发育分析

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中国畜牧兽医 2015年第8期42卷 1943-1949页

作者：梅雪芳李树清胡长红黄腾飞陈志飞黄维义广西大学动物科技学院南宁530005 上海出入境检验检疫局上海200135 罗氏诊断产品(上海)有限公司上海200335

本试验将从犬猫肠道中分离的钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫用盐酸卡红染色后观察其形态学特征;PCR扩增其ITS2基因序列并测序,并将测序结果与GenBank同属异形科的多棘单睾吸虫和横川后殖吸虫序列进行比对;应用Mega 6.05软件采用邻位相连法... 详细信息

本试验将从犬猫肠道中分离的钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫用盐酸卡红染色后观察其形态学特征;PCR扩增其ITS2基因序列并测序,并将测序结果与GenBank同属异形科的多棘单睾吸虫和横川后殖吸虫序列进行比对;应用Mega 6.05软件采用邻位相连法构建种系发育树进行分析。盐酸卡红染色后显示,钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫各形态学特征符合经典的分类学描述。PCR测序后获得钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫ITS2序列长度分别为295和297bp,G＋C含量分别为49.5%（146/295）和54.2%（161/297）。提交至GenBank后获得登录号分别为钩棘单睾吸虫KJ137221-KJ137223,KP165437-KP165439;扇棘单睾吸虫KP165440。序列比对结果显示,钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫种内差异性为0,4种异形吸虫种间差异为15.2%-28.9%。基于ITS2序列建立的种系发育树显示钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫构成自展值为78%的拓扑分支。

关键词：钩棘单睾吸虫扇棘单睾吸虫 ITS2基因种系发育分析

虫卵ITS-2基因序列鉴别华支睾吸虫与扇棘单睾吸虫研究及应用

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虫卵ITS-2基因序列鉴别华支睾吸虫与扇棘单睾吸虫研究及应用

作者：吕国丽广西医科大学

学位级别：硕士

目的建立以分子生物学技术为基础的华支睾吸虫与扇棘单睾吸虫的鉴别诊断方法，评估华支睾吸虫流行区内扇棘单睾吸虫感染的比重。方法在华支睾吸虫流行区采集华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫成虫，从成虫虫体中直接分离两种虫卵，收集、保存作... 详细信息

目的建立以分子生物学技术为基础的华支睾吸虫与扇棘单睾吸虫的鉴别诊断方法，评估华支睾吸虫流行区内扇棘单睾吸虫感染的比重。方法在华支睾吸虫流行区采集华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫成虫，从成虫虫体中直接分离两种虫卵，收集、保存作为实验样本，提取两种吸虫虫卵的基因组DNA，PCR扩增ITS-2序列，将PCR扩增产物电泳并根据条带大小判断虫种，将PCR扩增产物纯化、测序，将测序得到的核酸序列经DNAStar软件整理分析并与NCBI GenBank已登录的序列比对做同源性分析，以确保结果正确;再将两种吸虫卵按虫卵数目不同分组实验以及与蛔虫、鞭虫、钩虫、蛲虫四种常见肠道线虫做交叉实验，检测本实验方法效度;最后以扶绥县现场粪检诊断为华支睾吸虫感染者的粪便为实验材料，将水洗沉淀后获得的虫卵及粪渣的混合物重复前述实验步骤，根据对PCR产物电泳后的条带有无及条带位置，推断粪检结果为“华支睾吸虫感染者”感染的吸虫虫种，分析评估华支睾吸虫流行区内扇棘单睾吸虫感染者的比重。结果分别对以华支睾吸虫卵及扇棘单睾吸虫卵基因组DNA为模板的PCR扩增产物电泳后，观察电泳图谱可以见到在400bp、500bp左右处各显示一条明显条带，在以两种虫卵DNA混合液为模板的PCR扩增产物的电泳图谱中，可见在400bp和500bp左右处各有一条明显条带，将测序得到的核酸序列进行Blast比对后，显示与NCBI GenBank中的相应序列高度同源;按虫卵数不同进行的分组实验中，电泳结果显示，实验组中不同虫卵数的华支睾吸虫样本均可在400bp左右处见到一条明显条带，扇棘单睾吸虫样本大部分可在500bp处见到明显条带;混入四种肠道线虫卵的试验样本，单独以任一种线虫卵DNA为模板进行的PCR扩增，扩增产物电泳后的电泳图谱均不见任何明显条带，而以混入了两种吸虫卵DNA为模板进行的PCR扩增，将扩增产物进行电泳后的电泳图谱则在相应位置出现明显条带;以加藤法检测吸虫虫卵阳性的粪便样本为实验材料进行虫种鉴定中，虫卵阳性样本的检出率为95.93%，其中华支睾吸虫感染者82人，占49.70%，扇棘单睾吸虫感染者76人，占46.06%，混合感染者7人，占4.24%。没检出的占4.07%。结论1.本方法可对粪便中华支睾吸虫卵和扇棘单睾吸虫卵进行有效鉴别，检验效度较高，可以作为两虫种的鉴别检测方法。2.扶绥县现场调查诊断为华支睾吸虫感染者近一半为误诊，该县人群华支睾吸虫感染率调查评估存在较大偏差。

关键词：华支睾吸虫扇棘单睾吸虫 ITS-2

广西扇棘单睾吸虫5.8S rRNA序列和二级结构研究

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广西扇棘单睾吸虫5.8S rRNA序列和二级结构研究

作者：赵同领广西医科大学

学位级别：硕士

目的:研究广西扇棘单睾吸虫和其它人体吸虫5.8S rRNA序列和二级结构,探讨人体吸虫二级结构的特征,揭示单睾吸虫之间的亲缘关系。方法:采集广西扶绥县扇棘单睾吸虫,提取其DNA,PCR扩增5.8S rDNA序列并测序。另外选用Genbank登录的7种人体... 详细信息

目的:研究广西扇棘单睾吸虫和其它人体吸虫5.8S rRNA序列和二级结构,探讨人体吸虫二级结构的特征,揭示单睾吸虫之间的亲缘关系。方法:采集广西扶绥县扇棘单睾吸虫,提取其DNA,PCR扩增5.8S rDNA序列并测序。另外选用Genbank登录的7种人体吸虫5.8S rDNA序列进行研究,包括:扇棘单睾吸虫、钩棘单睾吸虫、巨片形吸虫、裂体吸虫、獾似颈吸虫、卷棘口吸虫和猫后睾吸虫。应用DNAman软件把上述人体吸虫5.8SrDNA基因转换成5.8S rRNA。应用RNAstructure3.2软件,根据最小自由能原理,采用Zuker算法,构建5.8S rRNA分子二级结构。应用SPSSv14.0软件对5.8S rRNA一级结构和二级结构组成进行统计分析,人工比对分析部分人体吸虫5.8S rRNA序列和二级结构特征。结果:对广西扇棘单睾吸虫与Dzikowski等报道的扇棘单睾吸虫5.8SrRNA序列进行比较,显示第81、83、84、129、143位碱基发生变异,但这些突变碱基均位于5.8S rRNA二级结构未配对碱基区,碱基突变并未影响5.8S rRNA二级结构。对广西扇棘单睾吸虫与钩棘单睾吸虫5.8S rRNA序列进行比较,发现既存在未配对碱基区的变异又存在配对碱基区的变异,配对区碱基的变异使两者5.8S rRNA二级结构呈现较大差异。对复殖目部分吸虫5.8S rRNA二级结构进行比对分析,结果显示:5.8S rRNA二级结构具有相同的基本结构模式;Ⅰ分支具有1个保守模序为5′-GUGUCGAUG:CAUCGACAU-3′(钩棘单睾吸虫为5′-GUGUCGAUG:CAUCGAUAU-3′)。Ⅱ分支具有1个保守发卡结构,该发卡结构的茎是由9个碱基对组成的保守模序,***保守模序为5′-GGCUACGGG:CCUGUGGCC-3′,其它7种保守模序为5′-GGCCAUGGG:CCUGUGGCC-3′;发卡环为富含尿嘧啶的6元环。在8种人体吸虫中,除裂体吸虫和猫后睾吸虫外,其它6种吸虫5.8SrRNA 5′端均有1段单链序列。在8种人体吸虫中,除钩棘单睾吸虫外,其余吸虫Ⅰ分支均有保守模序5′-GCAG:CUGC-3′。钩棘单睾吸虫和裂体吸虫与其它6种吸虫具有不同的H部和多分支环。巨片形吸虫、獾似颈吸虫和卷棘口吸虫Ⅰ分支尾端具有一个保守发卡结构。碱基的替代、丢失和插入多发生于5.8S rRNA二级结构单链区,双链区的替代、丢失和插入则往往会引起二级结构的较大变异。结论:本研究首次获得广西扇棘单睾吸虫5.8S rRNA基因序列,发现人体吸虫5.8S rRNA二级结构的一些特征。根据单睾吸虫二级结构特征,本研究还发现广西扇棘单睾吸虫与Dzikowski等报道的扇棘单睾吸虫亲缘关系比较近,与钩棘单睾吸虫亲缘关系比较远。

关键词：扇棘单睾吸虫 DNA测序二级结构模序

广西扇棘单睾吸虫5.8S rRNA序列及二级结构的研究

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应用预防医学 2007年第4期13卷 193-196页

作者：杨益超黎学铭赵同领李树林许洪波吴钦华商少明谢祖英区方奇黄铿凌麦富珍广西壮族自治区疾病预防控制中心南宁530021 广西医科大学南宁530021

目的比较分析广西人体扇棘单睾吸虫、扇棘单睾吸虫和钩棘单睾吸虫5.8SrRNA序列及二级结构,探讨他们的进化关系。方法提取广西扇棘单睾吸虫DNA,PCR扩增并测定5.8SrDNA序列;登录GenBank获取扇棘单睾吸虫和钩棘单睾吸虫5.8SrDNA序列。应用... 详细信息

目的比较分析广西人体扇棘单睾吸虫、扇棘单睾吸虫和钩棘单睾吸虫5.8SrRNA序列及二级结构,探讨他们的进化关系。方法提取广西扇棘单睾吸虫DNA,PCR扩增并测定5.8SrDNA序列;登录GenBank获取扇棘单睾吸虫和钩棘单睾吸虫5.8SrDNA序列。应用相关软件将5.8SrDNA基因转换成5.8SrRNA。采用Zuker算法,构建5.8SrRNA分子二级结构;计算3种吸虫间的遗传距离和同源性,分析5.8SrRNA序列及其二级结构特征。结果广西人体扇棘单睾吸虫与扇棘单睾吸虫5.8SrRNA分子序列比较显示第81、83、84、129和143位共5个碱基发生变异,这些突变碱基均位于5.8SrRNA分子二级结构未配对碱基区,未引起5.8SrRNA二级结构的明显变化;与钩棘单睾吸虫比较,显示第13、27、49、66、99、152、157位共7个碱基发生变异,其中3个碱基发生在配对区,4个替代发生在未配对区,碱基变异引起两种吸虫5.8SrRNA二级结构的明显不同;广西扇棘单睾吸虫与扇棘单睾吸虫和钩棘单睾吸虫的遗传距离分别为0.031和0.044,同源性分别为96.9%和95.6%。结论广西人体扇棘单睾吸虫5.8SrRNA序列与扇棘单睾吸虫高度同源,二级结构无明显不同,与钩棘单睾吸虫同源性较低,二级结构明显不同。

关键词：扇棘单睾吸虫 5.8S rRNA 二级结构

广西肝吸虫流行区人群及淡水鱼扇棘单睾吸虫感染调查

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应用预防医学 2012年第2期18卷 75-77页

作者：杨益超李树林谭裕光 K.S.Eom 许洪波吴钦华区方奇商少明广西壮族自治区疾病预防控制中心南宁530028 韩国忠北国立大学

目的了解扇棘单睾吸虫在广西人群和淡水鱼中的感染情况。方法在肝吸虫流行地区,采用Kato-Katz法检查居民粪便,选择部分吸虫卵阳性者驱虫并收集扇棘单睾吸虫成虫;采用压片和消化法检查鱼类扇棘单睾吸虫囊蚴。结果在5个调查点调查了671人... 详细信息

目的了解扇棘单睾吸虫在广西人群和淡水鱼中的感染情况。方法在肝吸虫流行地区,采用Kato-Katz法检查居民粪便,选择部分吸虫卵阳性者驱虫并收集扇棘单睾吸虫成虫;采用压片和消化法检查鱼类扇棘单睾吸虫囊蚴。结果在5个调查点调查了671人,发现吸虫卵阳性者383例,感染率57.08%,在阳性者中选择128人进行驱虫,有73人排出扇棘单睾吸虫成虫,占驱虫人数的57.03%,其中马山调查点占90.47%。在流行区内收集和消化了鱼类40余种,有17种鱼发现了扇棘单睾吸虫囊蚴:鲢鱼、鲫鱼、花鱼骨、海南似鱼乔、鲤鱼、棒花鱼、、Culter recurviceps、达氏鲌、南方拟餐、马口鱼、条纹小鲃、线细鳊、麦鲮、达氏鲌、蛇鮈、银鮈。其中,鲤鱼和鲫鱼为流行区人群最常生吃的鱼类。结论广西肝吸虫病流行区人群粪检吸虫卵阳性者中,有相当一部分为扇棘单睾吸虫感染,17种鱼检出该虫囊蚴,鲤鱼、鲫鱼等很可能是人感染的主要传播宿主。

关键词：扇棘单睾吸虫淡水鱼感染率

虫卵ITS-2序列分析鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的研究

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内科 2014年第2期9卷 128-130,123页

作者：吕国丽杨益超蒋智华韦海艳张伟尉唐雯茜林源黄福明区方奇广西医科大学南宁市530021 广西壮族自治区疾病预防控制中心南宁市530021

目的建立以分子生物学技术为基础的华支睾吸虫与扇棘单睾吸虫的ITS-2序列分析鉴别方法。方法在华支睾吸虫流行区采集华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫成虫,从成虫虫体分离并收集虫卵。以蛔虫、鞭虫、钩虫、蛲虫做对照虫种,按不同虫种和虫卵数分... 详细信息

目的建立以分子生物学技术为基础的华支睾吸虫与扇棘单睾吸虫的ITS-2序列分析鉴别方法。方法在华支睾吸虫流行区采集华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫成虫,从成虫虫体分离并收集虫卵。以蛔虫、鞭虫、钩虫、蛲虫做对照虫种,按不同虫种和虫卵数分成5个实验组,各组分别提取DNA,并扩增ITS-2序列,对扩增产物进行测序并作同源性分析以确保为目标片段,根据PCR扩增产物电泳获得的条带判定虫种。结果以华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫虫卵DNA为模板的PCR产物电泳图谱分别在400bp、500bp左右各显示一条明显条带;在以两种虫卵DNA混合液为模板的PCR产物中,电泳图谱在400bp左右和500bp左右各显示明显条带。将测序得到的两种核苷酸序列进行Blast比对后,显示与GenBank中相应的华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫序列高度同源。混入四种肠道线虫虫卵DNA的PCR产物中,除目的条带外,无其他条带。结论该方法可以对华支睾吸虫及扇棘单睾吸虫虫卵进行鉴别,且结果不受常见四种肠道线虫虫卵干扰,敏感性和特异性较高,可作为两虫种的鉴别检测方法。

关键词：华支睾吸虫扇棘单睾吸虫 ITS-2 鉴别方法

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广西人体扇棘单睾吸虫研究

广西人体扇棘单睾吸虫研究