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刚地弓形虫微线体蛋白6和醛缩酶在虫体内的定位

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新乡医学院学报 2013年第2期30卷 86-89页

作者：尹志奎郑斌姚志军刘世国任红斌许兵红张海珠新乡医学院药理学教研室河南新乡453003 新乡医学院寄生虫学教研室河南新乡453003

目的观察刚地弓形虫微线体蛋白6(MIC6)和醛缩酶在虫体内的定位。方法聚合酶链反应扩增微线体蛋白2羧基端(MIC2C)基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1/BL21表达系统,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达谷胱苷肽巯基转移酶-MIC2C(GST-MIC2C)蛋白... 详细信息

目的观察刚地弓形虫微线体蛋白6(MIC6)和醛缩酶在虫体内的定位。方法聚合酶链反应扩增微线体蛋白2羧基端(MIC2C)基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1/BL21表达系统,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达谷胱苷肽巯基转移酶-MIC2C(GST-MIC2C)蛋白,用该蛋白免疫新西兰兔,制备GST-MIC2C多克隆抗体。刚地弓形虫速殖子涂片,分别用一抗、荧光二抗温育,荧光显微镜下观察。结果成功获得GST-MIC2C多克隆抗体。荧光显微镜下显示MIC6(红色荧光)和醛缩酶(绿色荧光)2种蛋白皆定位于弓形虫的顶端。结论刚地弓形虫MIC6与醛缩酶在虫体内存在共定位关系,为2种蛋白相互作用关系的确立提供了细胞定位学证据。

关键词：刚地弓形虫微线体蛋白6 醛缩酶定位

弓形虫MIC 6羧基端蛋白片段的表达及其多克隆抗体的制备

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中国人兽共患病学报 2009年第9期25卷 870-874页

作者：郑斌何蔼李卓雅郑小英张瑞琳杨潇詹希美中山大学中山医学院寄生虫学教研室广州510080 新乡医学院新乡453000

目的克隆表达刚地弓形虫微线体蛋白6羧基端蛋白片段(Tg MIC6C),制备多克隆抗体。方法PCR扩增目的基因片段,克隆到pGEX-4T-1载体上,构建MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC6C融合蛋白,亲和层析融合蛋白;用纯化的融合蛋白... 详细信息

目的克隆表达刚地弓形虫微线体蛋白6羧基端蛋白片段(Tg MIC6C),制备多克隆抗体。方法PCR扩增目的基因片段,克隆到pGEX-4T-1载体上,构建MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC6C融合蛋白,亲和层析融合蛋白;用纯化的融合蛋白混合免疫佐剂免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,纯化并分析抗体的特异性。结果构建了MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统并获得纯化的GST-MIC6C融合蛋白;获得了抗目的蛋白的多克隆抗体,抗体能特异地识别目的蛋白,抗体效价为1∶8 000。结论在体外获得了纯化的GST-MIC6C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续GSTpull-down筛选与MIC6相互作用的蛋白奠定了基础。

关键词：刚地弓形虫微线体蛋白6 蛋白表达多克隆抗体

TgMIC6的优化表达及其多克隆抗体的制备

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中国病原生物学杂志 2019年第2期14卷 155-160页

作者：李婧旸韩成建刘志远张德然余莉安徽医科大学病原生物学教研室病原生物学安徽省重点实验室人兽共患病安徽省高校重点实验室安徽合肥230032 安徽医科大学合肥第三临床学院合肥市第三人民医院检验科

目的原核表达弓形虫微线体蛋白6(TgMIC6)结构功能域,并制备其多克隆抗体。方法运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫MIC6(TgMIC6)功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30... 详细信息

目的原核表达弓形虫微线体蛋白6(TgMIC6)结构功能域,并制备其多克隆抗体。方法运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫MIC6(TgMIC6)功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30a-MIC6重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,经His亲和层析纯化后以His单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体纯化后分别运用ELISA和Western blot对其效价和特异性进行分析。结果成功构建了pET30a-MIC6原核表达载体。表达的TgMIC6融合蛋白相对分子质量为45×10~3,与预期相符,纯化后浓度为0.5 mg/ml。以纯化的融合蛋白为抗原制备兔源性抗血清,ELISA测定其效价为1∶25 600,抗体浓度3.2 mg/ml,纯度>90%,Western blot显示该抗体能识别TgMIC6重组蛋白和不同虫株内的天然MIC6蛋白。结论优化后的TgMIC6功能区在原核表达系统内高效表达,制备的TgMIC6多克隆抗体效价高,特异性强,可识别重组菌和不同虫株表达的TgMIC6。

关键词：刚地弓形虫微线体蛋白6 多克隆抗体

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弓形虫MIC6突变体的构建及其特性分析

生物技术 2014年第3期24卷 50-52页

作者：尹志奎赵林静郑斌詹希美新乡医学院药理学教研室河南新乡453000 新乡医学院寄生虫学教研室河南新乡453000 中山大学中山医学院寄生虫学教研室广东广州510089

目的:体外构建弓形虫微线体蛋白6(MIC6)突变体并分析其特性。方法:利用基因定点突变的方法,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)的348位色氨酸的碱基突变为缬氨酸的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段;构建MIC6C W/V/pGEX-4T-1重组原核表达系统,I... 详细信息

目的:体外构建弓形虫微线体蛋白6(MIC6)突变体并分析其特性。方法:利用基因定点突变的方法,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)的348位色氨酸的碱基突变为缬氨酸的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段;构建MIC6C W/V/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白。以该蛋白为探针蛋白与弓形虫裂解液进行GST沉降实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果:获得了MIC6C W/V突变体基因片段,制备了GST-MIC6C W/V突变体蛋白;MIC6C W/V突变体蛋白的沉降产物中未见蛋白条带,而MIC6C蛋白(未突变蛋白)的产物中有一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体识别。结论:在体外获得了MIC6突变体;MIC6突变体失去了与醛缩酶作用的特性。

关键词：刚地弓形虫微线体蛋白6 点突变突变体 GST沉降技术