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亲和层析法用于噬菌体抗体库的筛选

病毒学报 2006年第1期22卷 44-49页

作者：陈瑛炜罗文新王明桥王晋李利峰袁权张军夏宁邵福建省医学分子病毒学研究中心厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门361005

本研究报道一种基于固定化金属亲和层析(IMAC)的噬菌体抗体库液相筛选方法。将纯化的带有His标签的抗原与噬菌体抗体库混合,噬菌体抗体与抗原充分结合后再加入亲和介质,使噬菌体抗体抗原复合物通过His标签与介质结合,然后通过充分洗涤... 详细信息

本研究报道一种基于固定化金属亲和层析(IMAC)的噬菌体抗体库液相筛选方法。将纯化的带有His标签的抗原与噬菌体抗体库混合,噬菌体抗体与抗原充分结合后再加入亲和介质,使噬菌体抗体抗原复合物通过His标签与介质结合,然后通过充分洗涤去除非特异性噬菌体抗体,最后将特异性噬菌体抗体洗脱下来,感染TG1,进行下一轮筛选。整个筛选过程中抗原与抗体的结合在液相中完成,不仅消除了固相介质对抗原表位的影响,也更有利于噬菌体抗体与抗原的充分作用。将此方法应用于HEV NE2蛋白特异性人源噬菌体抗体的筛选,抗原竞争ELISA,阳性血清阻断,可溶性单链抗体表达检测及测序结果表明,最终获得2个特异性人源抗体。

关键词：噬菌体抗体库固定化金属亲和层析液相筛选

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抗EGFRvⅢ噬菌体抗体库的构建和筛选

中国生物工程杂志 2010年第4期30卷 1-7页

作者：周敏石必枝顾健人李宗海上海交通大学医学院上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室上海200032

目的:应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш(epidermal growth factorreceptor variant typeⅢ,EGFRvIII)的单链抗体(single chain Fv,scFv)。方法:利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv基因,连接至噬菌粒pCANTAB5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化***2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达。结果:构建了库容为7.9×107的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv基因序列长807bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv可分别与纯化的EGFRvⅢex抗原以及细胞表面的EGFRvⅢex结合。结论:利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvⅢ scFv,为开发针对EGFRvⅢ的抗体药物提供了靶向载体分子。

关键词：表皮生长因子受体突变体Ⅲ 噬菌体抗体库单链抗体

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

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中国生物工程杂志 2012年第9期32卷 22-27页

作者：王晓娜米志强安小平李建彬范华昊张文慧张博黄勇周丽君童贻刚军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 中国人民解放军海军总医院中心研究室北京100037

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白(alpha-crystallin Acr)的人源抗体。方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核... 详细信息

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白(alpha-crystallin Acr)的人源抗体。方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析。将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群。成功制备了可溶性单链抗体。Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合。结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础。

关键词：结核分枝杆菌 Acr 蛋白噬菌体抗体库单链抗体

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从构建的噬菌体抗体库中筛选抗甲肝人单抗

生物工程学报 1998年第3期14卷 294-297页

作者：万泽生王海涛姜绍谆第三军医大学微生物学教研室军事医学科学院微生物流行病研究所第四军医大学微生物学教研室

用固相化甲肝抗原，对所构建的噬菌体抗体库进行了３轮淘筛。第３轮淘筛后洗脱下来的噬菌体，较第１轮增加了近１００倍。含有抗体重链基因和轻链基因的重组克隆，也由淘筛前的２５％增至１００％。说明甲肝抗原对抗体库的淘筛，富集了... 详细信息

用固相化甲肝抗原，对所构建的噬菌体抗体库进行了３轮淘筛。第３轮淘筛后洗脱下来的噬菌体，较第１轮增加了近１００倍。含有抗体重链基因和轻链基因的重组克隆，也由淘筛前的２５％增至１００％。说明甲肝抗原对抗体库的淘筛，富集了表面呈现甲肝人单抗的噬菌体。经夹心ＥＬＩＳＡ法筛选到抗甲肝病毒噬菌体抗体，并以竞争抑制实验进一步证实了这些抗体的特异性。

关键词：噬菌体抗体库人单克隆抗体甲肝病毒

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从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体

中国免疫学杂志 2000年第1期16卷 5-7页

作者：王刚化冰王琰刘玉峰解放军海军总医院北京100037

目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原，通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体，对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定。结果：经过４轮筛选，获... 详细信息

目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原，通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体，对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定。结果：经过４轮筛选，获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆，其中可产生特异性抗角蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析，判断所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。经切除基因Ⅲ后１个克隆表达出可与角蛋白特异性结合的可溶性Ｆａｂ，序列分析表明其Ｖ和ＶＨ分别属于人Ｖ１亚群和ＶＨ１亚群，ＶＨＣＤＲ３序列符合半合成抗体库构建时的引物设计。结论：利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫制备出高特异性的人源性抗角蛋白抗体。

关键词：噬菌体抗体库角蛋白单克隆抗体

利用噬菌体抗体库制备人源性抗β_2糖蛋白-Ⅰ抗体

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中国病理生理杂志 2009年第12期25卷 2494-2496页

作者：张秀茹张铁英王刚北京大学航天临床医学院病理科北京100049 吉林省人民医院肿瘤二疗区吉林长春130021 第四军医大学西京医院皮肤科陕西西安710032

目的:制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ(β2GPI)抗体Fab片段。方法:以人β2GPI为抗原,从人源性天然抗体库中筛选特异性Fab抗体,并用ELISA方法对所获抗体进行抗原结合活性和特异性鉴定。结果:通过4轮"亲和吸附-洗脱-扩增"筛选,获得2株抗β2GPI... 详细信息

目的:制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ(β2GPI)抗体Fab片段。方法:以人β2GPI为抗原,从人源性天然抗体库中筛选特异性Fab抗体,并用ELISA方法对所获抗体进行抗原结合活性和特异性鉴定。结果:通过4轮"亲和吸附-洗脱-扩增"筛选,获得2株抗β2GPI抗体。酶切去掉载体上的噬菌体基因III,得到了可溶性表达的Fab段。经过鉴定,所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。结论:利用人源性天然抗体库成功制备了2株抗β2GPIFab抗体,为深入研究该抗体在抗磷脂抗体综合征发病机理中的作用和探讨新的治疗措施奠定了基础。

关键词：噬菌体抗体库 β2糖蛋白-Ⅰ 抗磷脂综合征

天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗羊抑制素基因工程单抗的筛选

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中国农业科学 2009年第1期42卷 299-303页

作者：苗向阳邵建军朱瑞良王建民中国农业科学院北京畜牧兽医研究所山东农业大学动物科技学院

【目的】构建单链抗体(ScFv)噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对... 详细信息

【目的】构建单链抗体(ScFv)噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提供了一种新的方法。

关键词：噬菌体抗体库单链抗体羊

人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

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中国人兽共患病学报 2007年第4期23卷 386-389页

作者：雷黎赵志荣朱绍春刘淼卞茂红张林杰沈际佳安徽医科大学病原生物学教研室安徽中医学院第一附属医院检验科合肥230031

目的利用噬菌体抗体展示技术构建人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库并进行初步鉴定。方法RT-PCR从对血吸虫感染有一定抗性成年人外周血淋巴细胞中扩增出人IgG轻链和重链Fd段基因片段,将其克隆入PComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库... 详细信息

目的利用噬菌体抗体展示技术构建人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库并进行初步鉴定。方法RT-PCR从对血吸虫感染有一定抗性成年人外周血淋巴细胞中扩增出人IgG轻链和重链Fd段基因片段,将其克隆入PComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并用限制性内切酶酶切、序列分析、DOT-BLOT以及SDS-PAGE等方法对噬菌体抗体库进行初步鉴定。结果噬菌体抗体库的滴度为6.2ⅹ1011/L,库容量为1.2ⅹ107,酶切鉴定结果显示噬菌体抗体库轻重链重组率达到66.6%,测序结果表明克隆入PComb3的是人免疫球蛋白轻链和重链基因,DOT-BLOT实验证明该抗体库表达了人源性的抗体,而SDS-PAGE证实了免疫球蛋白Fab段的可溶性表达。结论成功地构建了人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库,为筛选人源性抗日本血吸虫的抗体、研究这些抗体的特性和功能奠定了基础。

关键词：日本血吸虫人源性噬菌体抗体库 Fab段抗体

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人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库的构建

解放军医学杂志 2001年第11期26卷 795-797页

作者：王彦刚章翔阎岩付洛安刘卫平吴景文郭庆东刘先珍第四军医大学西京医院第四军医大学微生物教研室

为构建人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,从脑胶质瘤患者外周血淋巴细胞 (PBL)中提取细胞总RNA ,经逆转录后用套式PCR分别扩增抗体轻链Vκ和重链VH基因。先构建Vκ基因库 ,并使连接Vκ和VH基因的linker与Vκ基因连接 ,再将VH基因克隆入Vκ... 详细信息

为构建人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,从脑胶质瘤患者外周血淋巴细胞 (PBL)中提取细胞总RNA ,经逆转录后用套式PCR分别扩增抗体轻链Vκ和重链VH基因。先构建Vκ基因库 ,并使连接Vκ和VH基因的linker与Vκ基因连接 ,再将VH基因克隆入Vκ基因库 ,即构建成功单链抗体 (ScFv)库。随机挑取菌落鉴定 ,测序表明从PBL中扩增出人源性Vκ和VH基因 ,并构建了库容量约为 2× 10 6的ScFv噬菌体抗体库。随机挑取克隆的测序表明 ,测定的VH基因与Kabat的抗体基因库中人抗体VH基因有较高的同源性 ,证明所克隆的基因属人抗体可变区基因。结果表明实验构建成人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库。

关键词：神经胶质瘤噬菌体抗体库单链抗体免疫治疗脑肿瘤 PBL 外周血淋巴细胞