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启动子克隆方法研究进展

中国生物工程杂志 2005年第7期25卷 9-16页

作者：李姗姗迟彦李凌飞马玺平文祥于冲周东坡黑龙江大学生命科学学院哈尔滨150080 东北农业大学食品科学学院北京林业大学生命科学院北京100083 黑龙江省科学院应用微生物研究所哈尔滨150080

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子的克隆对于构建基因工程载体,表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用,此后... 详细信息

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子的克隆对于构建基因工程载体,表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用,此后相继问世的一些基于PCR法的克隆启动子技术,像I-PCR、P-PCR、SSP-PCR、YADE、TAIL-PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。对这几种方法进行了简要综述,比较了不同方法的优缺点,并展望了今后的研究前景。

关键词：研究进展克隆方法启动子探针型载体 TAIL-PCR SSP-PCR 基因表达调控基因工程载体启动子克隆 PCR方法顺式元件组成部分表达载体目的蛋白 PCR法研究前景优缺点

粗毛栓菌(Trametes gallic)基因启动子的分离与鉴定

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四川大学学报（自然科学版） 2002年第2期39卷 340-344页

作者：胡敏珊张义正曾凡亚四川大学生命科学学院成都610064

粗毛栓菌 (Trametesgallic)总DNA经Sau3AI酶切后插入到启动子探针型载体pSUPV8的BamHI位点 ,在含氨苄青霉素与潮霉素双抗平板上筛选到 8个潮霉素抗性(Hygr)重组子 (命名为 pTP1～ 8) ,其插入片段大小为 0 .5～ 1.7kb ,抗性水平为 0 .15... 详细信息

粗毛栓菌 (Trametesgallic)总DNA经Sau3AI酶切后插入到启动子探针型载体pSUPV8的BamHI位点 ,在含氨苄青霉素与潮霉素双抗平板上筛选到 8个潮霉素抗性(Hygr)重组子 (命名为 pTP1～ 8) ,其插入片段大小为 0 .5～ 1.7kb ,抗性水平为 0 .15× 10 - 3 ～0 .35× 10 - 3 g/mL .对 pTP6进行酶切分析表明 ,插入片段中含有KpnI ,XbaI和SacI位点各一个 ,用限制酶SacI和XbaI去掉其 5’端 0 .7kb和 1.2kb片段后 ,其潮霉素抗性由 0 .2 5×10 - 3 g/mL均降为 0 .15× 10 - 3 g/mL .将TP5片段与粗毛栓菌总DNA进行Southern杂交 ,结果证明 ,TP5片段来源于粗毛栓菌总DNA .对片段TP5的 3’端进行序列分析。

关键词：粗毛栓菌基因启动子 Hyg^r基因启动子探针型载体基因分基基因表达潮霉素抗性序列分析

Nisin抗性乳酸菌的筛选及Nisin启动子的克隆

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Nisin抗性乳酸菌的筛选及Nisin启动子的克隆

作者：都立辉东北农业大学

学位级别：硕士

乳酸菌是应用最为广泛的食品级益生菌。虽然我国的乳酸菌资源十分丰富，但对其研究还处于初级阶段。这也正是给予我们食品工作者的机遇和挑战，大力推进关于乳酸菌的基础研究和开发应用，利用当今先进的生物技术(如蛋白质工程、基因工... 详细信息

乳酸菌是应用最为广泛的食品级益生菌。虽然我国的乳酸菌资源十分丰富，但对其研究还处于初级阶段。这也正是给予我们食品工作者的机遇和挑战，大力推进关于乳酸菌的基础研究和开发应用，利用当今先进的生物技术(如蛋白质工程、基因工程、细胞工程等)开发新的优良工程菌株，必将从根本上改变我国传统的乳酸菌利用方式。增进乳酸菌益生作用的途径之一是使其表达一些同源或异源的目的蛋白，这就需要可靠的表达系统的协助。在这方面，国际上广泛使用的是采用Nisin启动子的NICE(Nisin-Controlled gene Expression)表达系统。启动子作为控制基因转录起始的第一个必要元件，在表达系统中占有头等重要的地位。推进启动子的相关研究，不仅为以后表达系统的构建奠定基础，还将使我们更进一步地理解原核生物基因表达调控的过程。本课题首先通过基本的形态学观察，从传统乳制品中分离乳酸菌;之后采用两倍稀释法从分离得到的乳酸菌中筛选对Nisin具有一定抗性的菌株，然后利用16S rRNA基因同源性分析对部分菌株进行鉴定。以黄色微球菌为指示菌，研究抗性菌株是否产生抑菌物质。对抑菌物质的理化性质(对热、pH和酶处理的稳定性)与Nisin的理化性质进行对比研究。综合对比研究和菌株的鉴定结果，确定Nisin产生菌。应用PCR方法，从Nisin产生菌中克隆nisA启动子片段，之后将该片段插入到启动子探针型载体pNZ273中，通过组织化学的方法检测β-葡糖苷酸酶活性，对克隆的片段进行功能验证。结果如下：本课题共分离出90株形态学观察为乳酸菌的菌株，其中50株为球菌。采用MRS固体培养基，当Nisin的添加量为0.0003 g·mL时，50株球菌中有15株能正常生长。用两倍稀释法对这些菌株的Nisin抗性进行的检测表明，大部分菌株对Nisin的抗性不超过0.00125 g·mL。 15株能在Nisin环境中正常生长的菌中有4株能产生抑菌物质，并且其中S7菌株产生的抑菌物质在高温处理(121℃，15 min)时具有良好的稳定性;酸性条件(pH=2)下，抑菌物质的稳定性要好于中性条件(pH=7)下;抑菌物质能被α-胰凝乳蛋白酶降解。这些性质与Nisin的理化性质一致。采用16S rRNA序列同源性分析将S7菌株进行了鉴定，鉴定结果为乳酸乳球菌。用PCR方法从S7菌株中克隆nisA启动子，获得了大小为214 bp的片段。测序结果表明该片段与已经公布的Nisin启动子序列具有一致性。将获得的序列连入启动子探针型载体pNZ273中，构建了重组质粒pDU273。将pDU273转化*** NZ9000之后，用20 ng·mL的Nisin诱导时，gusA基因获得了表达。本课题主要得出以下结论：采用两倍稀释法，通过逐步提高环境中Nisin的含量来筛选Nisin抗性菌株的方法切实可行。 16S rRNA序列用于细菌鉴定已经成为一项常规的实验技术，随着GenBank中16S rRNA序列数据的爆炸式增长，这一技术对细菌的鉴定更加具有快速准确的特点。本课题中克隆获得的启动子片段能够启动启动子探针型载体pNZ273下游报告基因gusA的表达，证明克隆片段具有诱导型启动子的作用，可以作为nisA启动子使用。

关键词：乳酸菌 nisA启动子 NICE表达系统启动子探针型载体

粗毛栓菌（Trametes gallic）基因启动子的分离与鉴定

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粗毛栓菌（Trametes gallic）基因启动子的分离与鉴定

作者：胡敏珊四川大学

学位级别：硕士

首先测定了粗毛栓菌(Trametes gallic)对潮霉素的敏感性。结果表明，100μg／mL的潮霉素便足以完全抑制粗毛栓菌在三种常用的具有代表性的培养基上的生长。将粗毛栓菌总DNA经Sau3Al酶切后插入到启到子探针型载体pSUPV8的BamHI位点，转... 详细信息

首先测定了粗毛栓菌(Trametes gallic)对潮霉素的敏感性。结果表明，100μg／mL的潮霉素便足以完全抑制粗毛栓菌在三种常用的具有代表性的培养基上的生长。将粗毛栓菌总DNA经Sau3Al酶切后插入到启到子探针型载体pSUPV8的BamHI位点，转化大肠杆菌(Escherichia coli)XL-1 Blue,获得具有潮霉素抗性的重组子8个，依次命名为pTP1-pTP8。限制酶切分析表明它们均含有插入片段，大小为0.6-1.7kb。各基因启动子在大肠杆菌细胞中的起动效率采用潮霉素抗性水平进行测定，最高者可达350μg／mL，最低者为150μg／mL。对重组质粒pTP6进行了限制酶谱分析，结果表明，TP6片段长1.7kb，内有KpnⅠ、XbaⅠ和SacⅠ位点各一个。对TP6片段进行的次克隆分析表明，去掉其5’-端和0.8kb和1.2kb片段后，其潮霉素抗性由250μg／mL均降为150μg／mL。推测该0.8kb片段中可能存在一个正调控序列。用TP5片段作为探针与BamHI和EcoRI酶切的粗毛栓菌总DNA进行Southern杂交结果表明，TP5片段来源于粗毛栓菌总DNA。对TP5的3’-端进行的序列分析结果表明，在600bp的序列中，存在典型的真核生物基因启动子结构特点，同时也具有与原核生物基因启动子相似的一些保守序列。实验结果还表明，潮霉素磷酸转移酶基因5’-端编码区核苷酸序列的改变，并不影响基因表达产物的生物学活性，证明该基因可用作报告基因用于基因启动子的分离，启动子效率的测定以及其它DNA调控片段功能的研究等。

关键词：次克隆分析粗毛栓菌 Southern杂交序列分析基因启动子潮霉素抗性启动子探针型载体

集胞藻6803中ndhK基因启动子结构与功能的初步分析

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集胞藻6803中ndhK基因启动子结构与功能的初步分析

作者：田丽芳上海师范大学

学位级别：硕士

约20年前,人们在蓝藻类囊体膜上发现了一种新型的光合膜蛋白复合体,称之为NADPH脱氢酶复合体（NDH-1）。到目前为止,人们已发现NDH-1复合体至少由18种亚基（NdhA-S）组成。其中ndhK基因与ndhC和ndhJ基因位于同一操纵子中。ndhK基因可受... 详细信息

约20年前,人们在蓝藻类囊体膜上发现了一种新型的光合膜蛋白复合体,称之为NADPH脱氢酶复合体（NDH-1）。到目前为止,人们已发现NDH-1复合体至少由18种亚基（NdhA-S）组成。其中ndhK基因与ndhC和ndhJ基因位于同一操纵子中。ndhK基因可受到高光、低碳等条件的强烈诱导而迅速大量转录表达,这意味着ndhK基因拥有一个可快速响应外界环境变化而调节基因表达的启动子,但该启动子的结构与功能尚不清楚。为了解ndhK基因启动子的结构与功能,我们首先采用5’RACE的方法将ndhK基因的转录起始位点定位于其起始密码子（ATG）上游160bp的T碱基处,并利用生物信息学分析手段,对该基因上游可能的调控序列区域进行分析,找到了四个可能的启动子核心区域。接着构建了一个能在大肠杆菌中进行启动子片段活性快速检测的探针型载体,根据上述信息学预测结果,设计了一系列的启动子删除分析片段,插入到启动子探针型载体中,再通过蛋白免疫方法对ndhK基因的启动子及其调控区域进行详细分析。通过分析发现在集胞藻6803中ndhK基因上游存在四个具在较高启动子活性的区域,分别是-374～-274bp,-438～-374bp,-604～-543bp,+1～+52bp,而在-543～-440bp区域则可能存在一个抑制ndhK基因表达的转录因子。为进一步验证构建的大肠启动子活性快速检测平台的准确性,我们利用pPT6803-1载体,将经上述分析后的一些启动子删除分析片段整合入野生集胞藻6803中,并对各转基因藻中报告基因LuxAB的发光量进行了定量检测并分析,实验结果表明,各转基因藻中LuxAB的发光量与大肠启动子活性快速检测平台所确定的启动子片段活性存在显著正相关性,从而证明大肠启动子活性快速检测平台的准确性。综上所述,我们找到了集胞藻6803中ndhK基因的转录起始位点;构建了一个能在大肠杆菌中快速检测启动子片段活性的启动子探针型载体。并利用该平台对集胞藻6803中ndhK基因上游的启动子区域进行分析,初步确定了该基因启动子的结构与功能。最终还通过转基因藻中报告基因的表达情况,对大肠启动子活性快速检测平台的准确性进行肯定。

关键词：蓝藻 NADPH脱氢酶 ndhK启动子转录起始位点启动子探针型载体

丝状真菌斜卧青霉JUA-10具有启动子功能的DNA片段的克隆与表达

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山东轻工业学院学报（自然科学版） 2002年第1期16卷 61-65页

作者：汪天虹汪浩王一彬山东大学微生物技术国家重点实验室山东济南250100

　将斜卧青霉JUA - 10染色体DNA的BamHI或PstI片段连接到大肠杆菌的启动子探针型载体pSUPV4上 ,克隆了 7个不同大小的具有启动子功能的DNA片段。卡那霉素抗性试验表明 ,含重组质粒的大肠杆菌均能耐受 10 0 μg/ml以上的卡那霉素 ,最高可... 详细信息

　将斜卧青霉JUA - 10染色体DNA的BamHI或PstI片段连接到大肠杆菌的启动子探针型载体pSUPV4上 ,克隆了 7个不同大小的具有启动子功能的DNA片段。卡那霉素抗性试验表明 ,含重组质粒的大肠杆菌均能耐受 10 0 μg/ml以上的卡那霉素 ,最高可达 110 0 μg/ml。说明斜卧青霉的某些DNA片段能在大肠杆菌中有效地启动基因表达。取抗性水平最高的 pPdsuI进一步进行限制酶谱分析 ,表明插入片段的分子量为 2 .4Kb。

关键词：斜卧青霉启动子功能 DNA片段启动子探针型载体丝状真菌克隆基因表达分子生物学

扩展青霉PF898脂肪酶基因启动子DNA片段的功能分析

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扩展青霉PF898脂肪酶基因启动子DNA片段的功能分析

华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会

作者：江贤章柯崇榕舒正玉田宝玉黄建忠工业微生物教育部工程研究中心福建师范大学生命科学学院

脂肪酶(lipase,EC3.***.1.3,三甘油酯水解酶)是一类重要工业用酶,广泛应用于洗涤剂、医药、食品、化妆品和皮革等方面。扩展青霉(Penicillium expansum)PF898是经多代诱变育种选育的脂肪酶高产菌株[1]。扩展青霉脂肪酶的晶体结构已得到揭... 详细信息

脂肪酶(lipase,EC3.***.1.3,三甘油酯水解酶)是一类重要工业用酶,广泛应用于洗涤剂、医药、食品、化妆品和皮革等方面。扩展青霉(Penicillium expansum)PF898是经多代诱变育种选育的脂肪酶高产菌株[1]。扩展青霉脂肪酶的晶体结构已得到揭示[2]、其基因也已被克隆并在毕赤酵母中实现了表达[3],但酶蛋白的表达仍然偏低。提高酶蛋白表达的一个关键因素在于表达载体中启动子与结构基因的匹配。已有文献报道,利用脂肪酶自身启动子可以提高目的基因的表达效果。本文通过长距离衔接头PCR(LA-PCR)方法克隆得到扩展青霉PF898脂肪酶基因5’端侧翼序列,经核酸数据库同源比对,发现该序列是一个新序列,提交GenBank数据库(GenBank accession DQ677520)。根据该核酸序列,并结合启动子软件对该序列可能存在的启动子片段的分析结果,经PCR扩增得到9条不同的亚克隆产物。将这些亚克隆片段分别定向连接到启动子探针型载体pSUPV4中,构建出以卡那霉素抗性基因为报告基因的重组载体,转化大肠杆菌,对该脂肪酶基因5’端侧翼序列的启动子功能进行分析,结果表明这些亚克隆片段均能在大肠杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达。其中卡那霉素抗性水平最高表现为3500μg/mL,最低表现为1000μg/mL。

关键词：启动子探针型载体扩展青霉脂肪酶启动子大肠杆菌

来源： cnki会议评论

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稻瘟病菌基因启动子的克隆和鉴定(简报)

西南大学学报(自然科学版) 1993年第6期 22-22页

作者：秦敏张义正王焰玲彭云良毛建辉何明四川大学生物工程学系四川省农科院植保所

采用工程技术,从稻瘟病菌基因组中克隆到35个基因启动子,并进行了分析比较研究。稻瘟病菌MG9211菌株,分离自发病的汕优—63叶片。以大肠杆菌启动子探针型载体P(supv6)为克隆载体。该载体具有氨苄青霉素抗性基因(Amp′)和卡那霉素抗性基... 详细信息

采用工程技术,从稻瘟病菌基因组中克隆到35个基因启动子,并进行了分析比较研究。稻瘟病菌MG9211菌株,分离自发病的汕优—63叶片。以大肠杆菌启动子探针型载体P(supv6)为克隆载体。该载体具有氨苄青霉素抗性基因(Amp′)和卡那霉素抗性基因(Kan′)。其中,Kan′基因的启动子已被除去,Kan′基因不能表达,只有在启动缺失的Kan′基因前,插入外源的DNA片段才具有启动

关键词：稻瘟病菌基因启动子启动子探针型载体