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广丰千金薯烟草花叶病毒lncRNA测序鉴定、原核蛋白表达及其序列分析

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中草药 2023年第11期54卷 3666-3675页

作者：尹明华张艳红李淑娟段俊蒋晓峰上饶师范学院生命科学学院江西上饶334001 上饶农业技术创新研究院江西上饶334001 上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室江西上饶334001 上饶市薯芋类作物种质保存与利用重点实验室江西上饶334001

目的对广丰千金薯Dioscorea polystachya *** Qianjin烟草花叶病毒进行鉴定、原核蛋白表达和序列分析,为广丰千金薯脱毒苗的培育和鉴定提供理论依据。方法通过lnc RNA测序鉴定广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白基因,利用大肠杆菌重组技术表达... 详细信息

目的对广丰千金薯Dioscorea polystachya *** Qianjin烟草花叶病毒进行鉴定、原核蛋白表达和序列分析,为广丰千金薯脱毒苗的培育和鉴定提供理论依据。方法通过lnc RNA测序鉴定广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白基因,利用大肠杆菌重组技术表达广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白基因包括复制酶1(ORF1)、复制酶2(ORF2)、RNA聚合酶、运动蛋白(movement protein,MP)、带电蛋白和外壳蛋白(coat protein,CP);广丰千金薯烟草花叶病毒CP、MP、RNA聚合酶、带电蛋白、ORF1和ORF2基因c DNA总长度分别为480、807、1425、123、4851、3351 bp,其蛋白分别由159、268、474、40、1613和1114个氨基酸组成;广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白除带电蛋白为疏水性蛋白质外,其余如ORF1、ORF2、RNA聚合酶、运动蛋白和外壳蛋白均为亲水性蛋白质;广丰千金薯烟草花叶病毒带电蛋白二级结构由β-片层和无规则卷曲构成,CP、MP、RNA聚合酶、ORF1和ORF2的二级结构均由α螺旋、β-片层、无规则卷曲构成;广丰千金薯烟草花叶病毒CP、MP、RNA聚合酶、带电蛋白、ORF1和ORF2三级结构均为单体;广丰千金薯烟草花叶病毒CP、MP、RNA聚合酶、带电蛋白、ORF1和ORF2的亚细胞定位分别为内质网、细胞核、细胞质、细胞核、线粒体、叶绿体;广丰千金薯烟草花叶病毒CP、MP、RNA聚合酶、带电蛋白、ORF1和ORF2与烟草花叶病毒的亲缘关系较近,同源性分别为99.79%、99.38%、99.23%、100%、99.38%、99.49%;广丰千金薯烟草花叶病毒复制酶、RNA聚合酶、MP和CP可实现大肠杆菌重组表达,表明广丰千金薯烟草花叶病毒的lnc RNA测序结果准确。结论广丰千金薯烟草花叶病毒与烟草花叶病毒同源性极高,氨基酸序列及核酸序列与烟草花叶病毒其他植物分离物相似度高,在进化上高度保守。

关键词：广丰千金薯烟草花叶病毒 lncRNA测序鉴定原核蛋白表达序列分析

番茄乙烯信号转录因子LeERF2在大肠杆菌中的表达和纯化

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高技术通讯 2007年第5期17卷 546-550页

作者：张红星朱本忠谢远宏张文杨祥龙尹胜李欣罗云波北京农学院食品科学系北京102206 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

从破色期番茄果实中提取了总RNA,用RT-PCR方法从中克隆到了627bp全长LeERF2基因。测序结果分析表明,该LeERF2基因序列与已发表序列的同源性为100%。将LeERF2基因亚克隆至载体pET-30a上,构建了原核表达载体pET-LeERF2,将其转化到大肠杆菌... 详细信息

从破色期番茄果实中提取了总RNA,用RT-PCR方法从中克隆到了627bp全长LeERF2基因。测序结果分析表明,该LeERF2基因序列与已发表序列的同源性为100%。将LeERF2基因亚克隆至载体pET-30a上,构建了原核表达载体pET-LeERF2,将其转化到大肠杆菌BL21中。蛋白质诱导表达的温度为37℃,诱导剂IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为3h,LeERF2表达蛋白在细菌沉淀中约占菌体总蛋白的58%。应用Ni-NTA亲和层纯化回收的LeERF2表达蛋白的纯度为99%。银染凝胶阻滞实验表明,LeERF2蛋白能与含有GCC盒的逆境相关的几丁质酶启动子基因TLBP1结合。

关键词：番茄乙烯 LeERF2 原核蛋白表达凝胶阻滞实验

小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)的原核表达及兔多克隆抗体的制备与鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2020年第9期36卷 826-832页

作者：蔡玥马仕昆董樾张薇夏蒙蒙牛长敏郑英扬州大学医学院组织学与胚胎学教研室江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室江苏扬州225009

目的原核表达小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)蛋白并制备兔抗小鼠Stra8多克隆抗体。方法应用分子克隆法构建pET28a-Stra8原核表达重组质粒,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Stra8蛋白表达,采用组氨... 详细信息

目的原核表达小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)蛋白并制备兔抗小鼠Stra8多克隆抗体。方法应用分子克隆法构建pET28a-Stra8原核表达重组质粒,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Stra8蛋白表达,采用组氨酸标签(His-TAG)亲和层析柱纯化原核蛋白。以纯化后的Stra8蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,制备Stra8多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体的效价,Western blot法检测制备的抗体对睾丸组织Stra8蛋白的识别能力以确定其有效性,免疫荧光组织化学染色法检测睾丸组织中Stra8蛋白的表达以确定多克隆抗体的特异性。结果pET28a-Stra8重组质粒经双酶切和测序鉴定正确,经诱导后能高效表达Stra8蛋白,应用His-TAG亲和层析法获得纯度较高的Stra8蛋白。应用纯化的Stra8蛋白连续免疫新西兰大白兔5次后,提取抗血清,经ELISA检测获得的Stra8多克隆抗体效价为1∶106,Western blot法分析显示多克隆抗体可特异性地识别睾丸组织中的内源性Stra8蛋白,免疫荧光染色法显示该多克隆抗体能够特异性的识别小鼠睾丸组织精原细胞表达的Stra8蛋白。结论在大肠杆菌中有效地诱导表达Stra8原核蛋白并制备了特异性的兔抗Stra8多克隆抗体。

关键词：小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8) 原核蛋白表达多克隆抗体制备

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组蛋白的制备及其对巨噬细胞的影响

中国病理生理杂志 2013年第5期29卷 883-888页

作者：付晓霞叶萍李雪钟玙沄崔航陈小欢蔡军伟姜勇刘靖华南方医科大学基础医学院病理生理学教研室、广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的:用不同方法制备组蛋白并观察组蛋白在体外对巨噬细胞活力及细胞因子释放的影响。方法:用基因克隆的方法构建组蛋白H3和H4的原核表达质粒,分别表达和纯化带谷胱甘肽S-转移酶(GST)和组氨酸(His)标签的组蛋白(GST-H3、GST-H4、His-H3... 详细信息

目的:用不同方法制备组蛋白并观察组蛋白在体外对巨噬细胞活力及细胞因子释放的影响。方法:用基因克隆的方法构建组蛋白H3和H4的原核表达质粒,分别表达和纯化带谷胱甘肽S-转移酶(GST)和组氨酸(His)标签的组蛋白(GST-H3、GST-H4、His-H3和His-H4);用高盐法提取真核细胞(RAW264.7和293F细胞)组蛋白;用上述不同来源组蛋白(7.5～50 mg/L)刺激巨噬细胞4 h,利用MTT和流式细胞术检测巨噬细胞活力;用液相芯片方法检测不同来源组蛋白对巨噬细胞释放在培养上清中的细胞因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度。结果:His-H3/H4和真核细胞来源的组蛋白明显降低细胞活性,诱导RAW264.7细胞发生晚期凋亡和坏死;不同来源组蛋白对RAW264.7细胞释放IL-6和TNF-α均有不同程度的促进作用。结论:原核表达His-H3、His-H4及真核细胞提取的组蛋白均可抑制巨噬细胞活力,诱导巨噬细胞发生晚期凋亡和坏死。组蛋白可能通过促进炎症细胞因子的释放参与了炎症反应过程。

关键词：原核蛋白表达组蛋白类巨噬细胞

杀香鱼假单胞菌鱼体内分布及其溶血素相关蛋白Hcp的克隆、表达

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杀香鱼假单胞菌鱼体内分布及其溶血素相关蛋白Hcp的克隆、表达

作者：陈卓浙江海洋大学

学位级别：硕士

大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国海水养殖的重要经济鱼类之一,因其营养丰富、肉质鲜美一直受到消费者的青睐。但是近年来,随着养殖规模的不断扩大,大黄鱼产业结构的升级与发展,大黄鱼的病害已成为制约大黄鱼养殖产业发展的主要屏障... 详细信息

大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国海水养殖的重要经济鱼类之一,因其营养丰富、肉质鲜美一直受到消费者的青睐。但是近年来,随着养殖规模的不断扩大,大黄鱼产业结构的升级与发展,大黄鱼的病害已成为制约大黄鱼养殖产业发展的主要屏障。大黄鱼“内脏白点病”是近年影响大黄鱼养殖的重要细菌性疾病。本研究通过人工回感实验,运用组织病理切片与免疫组化技术观察了大黄鱼“内脏白点病”病原——杀香鱼假单胞菌在大黄鱼体内的分布情况;对杀香鱼假单胞菌的溶血素共调节蛋白基因Hcp进行克隆、表达,并获得了以包涵体形式的重组蛋白Hcp,通过蛋白复性后成功获得可溶性蛋白,可运用于杀香鱼假单胞菌T6SS分泌系统中溶血素共调节蛋白Hcp深层研究。对健康大黄鱼进行杀香鱼假单胞菌人工感染试验,结果大黄鱼表现出了典型的“内脏白点病”的症状:病鱼无活力,反应迟钝。解剖发现脾、肾脏、肝脏等内部器官上长满白点,并伴随腹水症状。对发病鱼进行组织病理观察,发病鱼肝、脾、肾等内脏组织都出现明显损伤,表现出不同程度的充血、出血、坏死等,随着菌体在大黄鱼体内大量增殖,大黄鱼全身多器官组织的细胞出现坏死溶解,最终导致感染鱼因多组织器官的功能衰竭而死亡。免疫组化试验结果显示,在病鱼的肝、脾、肾和鳃丝各相关组织器官中都出现了特征性的阳性信号,这些阳性信号主要分布于肝血窦、脾间质或巨噬细胞、肾间质活巨噬细胞以及腮丝的巨噬细胞内,表明杀香鱼假单胞菌对机体多组织、器官都具有侵染性。运用分子生物学技术克隆、表达了杀香鱼假单胞菌分泌系统T6SS中的溶血素共调节蛋白Hcp。PCR扩增结果显示Hcp大小约为490bp,相对蛋白质分子量约为25kDa,pET-30a-Hcp的重组蛋白主要以包涵体形式表达。对纯化后的包涵体蛋白进行复性,Western-blot结果显示pET-30a-Hcp重组蛋白可与多抗进行较好地结合;本研究为进一步研究杀香鱼假单胞菌的致病机理以及其T6SS中的溶血素共调节蛋白Hcp奠定了基础。

关键词：人工回感实验病理切片免疫组化原核蛋白表达 Western-blot 蛋白复性

病原诱导的小麦ERF转录因子TaERF1b的原核表达及纯化

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植物遗传资源学报 2008年第3期9卷 283-287页

作者：董娜张增艳辛志勇中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部作物遗传育种重点开放实验室北京100081

为了得到纯化的TaERF1b活性蛋白,将TaERF1 b基因含有AP2/ERF结构域的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点中,构建GST-TaERF1b融合蛋白表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。0.1mmol/L IPTG即能诱导融合蛋白表达,37℃诱导4h或3... 详细信息

为了得到纯化的TaERF1b活性蛋白,将TaERF1 b基因含有AP2/ERF结构域的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点中,构建GST-TaERF1b融合蛋白表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。0.1mmol/L IPTG即能诱导融合蛋白表达,37℃诱导4h或30℃诱导8h,融合蛋白均以包涵体的形式表达,16℃诱导12h,融合蛋白不表达。包涵体经溶解及稀释复性后,过GST亲和层析柱,获得纯化的融合蛋白,考马斯亮蓝法测得纯化蛋白的浓度约为0.5μg/μl,凝胶阻滞实验表明包涵体复性成功,所得蛋白具有生物活性。

关键词： ERF(ethylene-responsive factor) TaERFlb 原核蛋白表达包涵体

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利用植物生物反应器制备白藜芦醇的相关研究

利用植物生物反应器制备白藜芦醇的相关研究

作者：韩晶晶山东师范大学

学位级别：硕士

植物生物反应器是指通过基因工程途径,将常见的农作物进行大规模种植从而生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂。具有经济、高效、安全的特点,其应用能够满足科研及人们日益增长的健康、... 详细信息

植物生物反应器是指通过基因工程途径,将常见的农作物进行大规模种植从而生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂。具有经济、高效、安全的特点,其应用能够满足科研及人们日益增长的健康、保健的需求。白藜芦醇(Resveratrol,简称Res)是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种植物抗毒素,还具有抗癌、抗氧化、调节血脂,影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。自然的条件下Res在植物体内的含量非常低,且用传统的提取方法获得高丰度的Res非常困难。白藜芦醇合酶(Resveratrol synthase,简称RS)是Res合成途径中最后一个起作用的关键酶,也是唯一必须的合成酶。本实验通过分子生物学手段,分离得到花生白藜芦醇合酶基因(PNRS1)的基因组DNA和cDNA,通过构建不同的表达载体,分别对大肠杆菌和植物进行遗传转化,己经取得了如下进展:利用RT-PCR技术从花生根部cDNA中扩增出PNRS1基因的cDNA(登陆号: FM955393),然后将其重组到克隆载体中。通过测序并进行序列比对证明,所获得的PNRS1基因与登陆号为AY170734的序列同源性达到95%。其编码的氨基酸序列与登陆号为AAO11837的氨基酸序列同源性达到96%,且序列中包含有RS的特征结构及活力位点,成功获得了花生PNRS1基因的cDNA。RT-PCR分析表明,PNRS1在花生根中特异表达,并可被紫外诱导表达。将测序正确的PNRS1基因与原核表达载体pET-28a融合获得读框正确的表达载体pET-28a-PNRS1。该载体转化大肠杆菌感受态后,经IPTG诱导后PNRS1能够正确表达,融合蛋白分子量约为46KD,与预期相符,且最适IPTG诱导浓度为1mmol/L,最佳诱导时间为3 h。证明实验中成功构建了花生RS的原核表达载体,优化了RS高效表达体系,为进一步深入研究花生RS的功能打下了基础。同时,将测序正确的花生RScDNA基因分别正向、反向插入到植物表达载体pBI121和修饰过的pCAMBIA1301的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,成功获得植物表达载体pBRS和p1301-35s-RS1。经农杆菌介导转入烟草,获得了若干转基因植株。利用紫外分光光度法及HPLC对部分转基因植株进行了白藜芦醇含量测定,证明白藜芦醇含量较对照植株均有提高。本实验在传统育种的基础上,通过基因工程手段,获得了花生RS基因并将其导入植物中,得到了Res含量变化及抗环境恶化能力提高的株系,为进一步将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高及作物抗逆性育种提供了指导。它的开发和利用,必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。

关键词：白藜芦醇(Res) 白藜芦醇合酶(RS) 花生PNRS1基因克隆原核蛋白表达紫外线损伤

HCVp7蛋白反式调节基因p7TP2生物学功能的研究

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HCVp7蛋白反式调节基因p7TP2生物学功能的研究

作者：袁菊西北农林科技大学

学位级别：硕士

目前世界上有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,危害严重,但目前还没有特效的治疗技术和方法。找出肝细胞中与HCV反式调节相关的基因,并进一步弄清具体作用机制、作用效应及连带影响,对明确HCV的致病机理,寻找有效防治方法有重要意义。HCV p7TP... 详细信息

目前世界上有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,危害严重,但目前还没有特效的治疗技术和方法。找出肝细胞中与HCV反式调节相关的基因,并进一步弄清具体作用机制、作用效应及连带影响,对明确HCV的致病机理,寻找有效防治方法有重要意义。HCV p7TP2是利用基因芯片筛选的HCV p7蛋白下调表达的靶基因,其许多功能仍需要进一步研究。本试验主要应用酵母双杂交技术、抑制性消减杂交技术、原核表达技术、实时荧光定量PCR等方法研究p7TP2基因的生物学功能。 1.以HepG2细胞cDNA为模板克隆出p7TP2基因,编码区为495bp （核苷酸）,应用生物信息学分析此基因位于8q24.3,半衰期为30h,属于不稳定蛋白,疏水指数较高,预测可能为具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及两个跨膜结构域。 2.应用实时荧光定量PCR验证HCV p7蛋白下调p7TP2基因的表达,并应用抑制性消减杂交筛选并构建p7TP2下调表达基因的消减文库,同源性分析p7TP2下调表达的基因主要位于线粒体,并与调控细胞增殖、分化、凋亡的信号传导通路有关。 3.利用原核表达系统,构建融合表达载体,IPTG诱导表达融合蛋白,证明其相对分子量约为33000,纯化融合蛋白,并免疫兔子,制备多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质免疫印迹,此抗体具有较高效价和特异性。 4.免疫组织化学检测p7TP2蛋白在阳性组织中分布在细胞浆,且在正常组织的表达量比病理组织高。构建绿色荧光蛋白GFP与p7TP2的融合基因,转入不同的细胞系HepG2及COS-7,荧光显微镜观察其亚细胞定位,显示荧光主要集中在细胞浆。 5.应用酵母双杂交系统,构建诱饵质粒pGBKT7-p7TP2,转化酵母细胞AH109,并与转化人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187配合,在营养缺陷型培养基和X-α-gal上进行双重筛选,测序,并进行生物信息学分析。结果显示p7TP2蛋白与一些直接和间接与抗凝血因子有关的蛋白基因具有相互作用,推测p7TP2蛋白可能直接或间接参与抗凝血过程。 6.选取p7TP2基因起始密码子ATG上游1203bp下游147bp的基因组DNA序列作为启动子,克隆并构建载体pCAT3-p7TP2-p和PGLB-p7TP2-p,应用CAT表达系统和双荧光素酶系统检测显示在不同的细胞系HepG2和Huh-7中均具有启动子活性;共转染试验显示HCV p7对p7TP2启动子活性具有下调作用。上述结论为进一步研究p7TP2基因的结构和功能提供了新的线索,也为HCV p7的反式调节作用及HCV发病机制研究奠定了基础。

关键词：克隆酵母双杂交抑制性消减杂交原核蛋白表达细胞定位

番茄乙烯信号转录因子LeERF1基因克隆和蛋白表达

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中国食品学报 2007年第3期7卷 49-54页

作者：张红星朱本忠谢远宏杨祥龙张文罗云波北京农学院食品科学系北京102206 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

为研究乙烯信号转录因子的功能,提取破色期番茄果实总RNA,通过RT-PCR获得615bp全长LeERF1基因。测序结果表明,与已发表序列同源性为100%。将LeERF1基因亚克隆至载体pET-30a上,构建原核表达载体pET-LeERF1并转化到大肠杆菌BL21中。采用... 详细信息

为研究乙烯信号转录因子的功能,提取破色期番茄果实总RNA,通过RT-PCR获得615bp全长LeERF1基因。测序结果表明,与已发表序列同源性为100%。将LeERF1基因亚克隆至载体pET-30a上,构建原核表达载体pET-LeERF1并转化到大肠杆菌BL21中。采用诱导温度37℃,诱导剂IPTG浓度1mmol/L,诱导时间3h,LeERF1表达蛋白在细菌中占菌体总蛋白的28%。

关键词：番茄乙烯 LeERF1 原核蛋白表达