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南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶的空间结构与活性位点分析

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中国食品学报 2016年第9期16卷 176-184页

作者：晏嫦妤任秋婧陈小芳李斌陈忠正华南农业大学食品学院广州510642 广东省农业科学院饮用植物研究所广州510640

咖啡碱合成酶是茶叶中咖啡碱生物合成途径的关键酶,目前尚无对茶叶咖啡碱合成酶分子结构和催化机制的报道。预测和分析其空间结构和活性位点具有重要意义。本研究以高咖啡碱南昆山毛叶茶为材料构建c DNA文库,采用同源探针筛选c DNA文库... 详细信息

咖啡碱合成酶是茶叶中咖啡碱生物合成途径的关键酶,目前尚无对茶叶咖啡碱合成酶分子结构和催化机制的报道。预测和分析其空间结构和活性位点具有重要意义。本研究以高咖啡碱南昆山毛叶茶为材料构建c DNA文库,采用同源探针筛选c DNA文库的方法获得咖啡碱合成酶基因,通过体外原核表达对其功能进行验证,并用Modeller9.10、Autodock4.0等软件预测其编码蛋白的空间结构和活性位点,结果是:克隆得到南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶基因MYCS1,其ORF全长1 100 bp,编码369个氨基酸,原核表达蛋白具有咖啡碱合成酶的功能;MYCS1编码蛋白的三维模型由9个α-螺旋、7个β-折叠组成,整个蛋白有一个包含β-折叠链的球形结构域和一个由独特螺旋帽组成顶盖的活性空腔。该蛋白经多氢键与甲基供体SAM结合,结合域由Asp63、Gly65、Asp103、Ser138、Phe139、Ser155等氨基酸残基构成,与甲基受体(7-m X、Tb)的结合主要通过氢键作用,并受氨基酸残基π-π堆积作用和强疏水作用的影响。结合域主要包括Phe30、Thr31、Tyr156、Trp160、Phe321等氨基酸残基。结论:南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶具有依赖S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶家族的结构特征,底物结合位点在保守结构域,与该家族酶存在共性,特异底物识别位点存在差异,该结果为深入研究茶叶咖啡碱合成酶的催化机制奠定了基础。

关键词：南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶空间结构活性位点

南昆山毛叶茶对tBHP诱导损伤NIH3T3细胞的保护效果

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食品工业科技 2021年第2期42卷 90-98页

作者：刘诗妤陈忠正林晓蓉张媛媛周浪花高雄李斌华南农业大学食品学院广东广州510642 广东省科学院广东省微生物研究所广东广州510070

本研究以南昆山毛叶茶为材料,探讨其水提物对叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,tBHP)诱导小鼠成纤维细胞NIH3T3氧化损伤的保护作用。以tBHP诱导NIH3T3细胞建立氧化损伤模型,采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,M... 详细信息

本研究以南昆山毛叶茶为材料,探讨其水提物对叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,tBHP)诱导小鼠成纤维细胞NIH3T3氧化损伤的保护作用。以tBHP诱导NIH3T3细胞建立氧化损伤模型,采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞存活率,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒测定细胞膜完整性。同时,检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,以及过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)抗氧化酶活性,评价其抗氧化能力,荧光探针测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)变化,分光光度法和Western blot检测caspase-3、caspase-9、细胞色素c的表达以探究其损伤保护机制。结果表明,与tBHP组相比,南昆山毛叶茶水提物在25~100μg/mL浓度范围内,细胞存活率由49.68%显著提高至81.69%;LDH活性由520.70 U/L降低至346.42 U/L。同时,可显著抑制ROS、MDA产生,均为tBHP组的0.02倍,增加GSH含量至tBHP组的3.07倍,提高CAT、GSH-Px、SOD等抗氧化酶活性,分别为tBHP组的1.42倍、2.48倍和1.77倍,提高MMP,抑制caspase-3、caspase-9、细胞色素c的表达。说明南昆山毛叶茶水提物能修复抗氧化系统,抑制线粒体细胞凋亡途径,有效减缓tBHP诱导的NIH3T3细胞氧化损伤。本研究初步揭示了南昆山毛叶茶的抗氧化机理,为这一特殊资源的更广泛开发利用提供了抗氧化功能特性的理论研究基础。

关键词：南昆山毛叶茶 tBHP诱导 NIH3T3细胞抗氧化活性保护效果

南昆山毛叶茶三种多酚的分离纯化及抗氧化研究

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食品工业科技 2020年第5期41卷 31-39页

作者：旷小珊高雄林晓蓉陈忠正李斌张媛媛华南农业大学食話学院广东广州510642 广东省微生物研究所广东广州510070

本研究以南昆山毛叶绿茶为材料,通过30%乙醇、乙酸乙酯提取,进而采用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和制备型高效液相色谱分离纯化得到3种多酚单体物质;通过高效液相色谱-串联质谱、核磁共振和红外光谱鉴定单体结构;以1,1-二苯... 详细信息

本研究以南昆山毛叶绿茶为材料,通过30%乙醇、乙酸乙酯提取,进而采用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和制备型高效液相色谱分离纯化得到3种多酚单体物质;通过高效液相色谱-串联质谱、核磁共振和红外光谱鉴定单体结构;以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2′-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)两种自由基的清除能力、铁离子还原能力(FRAP)和氧自由基的吸收能力(ORAC)为指标,运用L-O2肝细胞氧化应激模型,综合评价3种多酚单体物质的抗氧化活性。结果:从南昆山毛叶茶中分离得到3种多酚单体物质,分别为没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、1,2,4,6-四没食子酰葡萄糖(1,2,4,6-GA-glc)、儿茶素-3,5-二没食子酸酯(GC-3,5-diGA),其中后2种为茶叶中的特殊多酚物质;纯度分别为98%、96%、97%,得率分别为2.45%、0.55%、0.31%;DPPH、ABTS和FRAP三种化学抗氧化结果基本一致:GCG>GC-3,5-diGA>1,2,4,6-GA-glc,ORAC法的结果与此相反,1,2,4,6-GA-glc的作用强于GCG和GC-3,5-diGA;高剂量的GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA预处理后,受氧化应激的L-O2细胞存活率分别提高了26.98%±1.96%、70.87%±3.61%和35.58%±5.37%。结论:通过Sephadex LH-20柱层析和制备型高效液相色谱技术,得到高纯度的GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA;抗氧化结果显示,GCG具有较强的化学抗氧化能力,1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA具有强细胞抗氧化能力。

关键词：南昆山毛叶茶分离鉴定多酚单体物质抗氧化

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南昆山毛叶茶cDNA文库构建

食品科学 2008年第5期29卷 337-340页

作者：文海涛陈忠正赵亮郭健李斌蒋跃明华南农业大学食品学院广东广州510642 浙江工商大学食品、生物与环境工程学院浙江杭州310035

本研究以天然低咖啡碱茶树品种—南昆山毛叶茶春季嫩稍为材料,采用Stratagene公司ZAP系列试剂盒成功构建了该品种全长cDNA文库。原始文库滴度为6.0×105pfu/ml,重组率为97.3%,1.0～2.0kb的插入片段占整个文库的70%左右,达到一个高质量c... 详细信息

本研究以天然低咖啡碱茶树品种—南昆山毛叶茶春季嫩稍为材料,采用Stratagene公司ZAP系列试剂盒成功构建了该品种全长cDNA文库。原始文库滴度为6.0×105pfu/ml,重组率为97.3%,1.0～2.0kb的插入片段占整个文库的70%左右,达到一个高质量cDNA文库的要求,文库经扩增后滴度为1.9×109pfu/ml,重组率达到99.1%。

关键词：南昆山毛叶茶 cDNA文库文库滴度

南昆山毛叶茶和云南大叶种的RAPD分子标记研究

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茶叶科学 2003年第2期23卷 146-150页

作者：李斌尹逸周英邓佩卿杨宏伟华南农业大学食品学院广东广州510642

采用RAPD分子标记技术对南昆山毛叶茶和云南大叶种进行DNA分子标记研究。从300个随机引物中筛选出36个有效引物共产生4382条DNA片段,平均每个单株扩增出109.55条带,片段大小分布在0.15 kb～3.70 kb之间。在扩增出的315条不同分子量的DN... 详细信息

采用RAPD分子标记技术对南昆山毛叶茶和云南大叶种进行DNA分子标记研究。从300个随机引物中筛选出36个有效引物共产生4382条DNA片段,平均每个单株扩增出109.55条带,片段大小分布在0.15 kb～3.70 kb之间。在扩增出的315条不同分子量的DNA谱带中,21条是单态的,294条是多态的,多态性高达93.33%,其中云南大叶种多态性谱带达286条,多态性为90.79%,南昆山毛叶茶多态性谱带有265条,多态性为84.13%。通过类平均聚类(UPGMA)法,绘制出南昆山毛叶茶与云南大叶种DNA之间的遗传关系树状图。

关键词： RAPD分子标记技术南昆山毛叶茶云南大叶种 DNA分子标记遗传多态性类平均聚类法遗传关系

南昆山毛叶茶对细胞氧化损伤的保护作用及机理初探

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南昆山毛叶茶对细胞氧化损伤的保护作用及机理初探

作者：刘诗妤华南农业大学

学位级别：硕士

南昆山毛叶茶(Camellia ptilophylla Chang)是一种天然低或无咖啡碱的珍稀茶树资源,其抗癌、减肥、抗氧化等功能特性已有研究,但通过构建细胞氧化损伤模型评价其抗氧化活性的研究尚未深入,因此本研究以南昆山毛叶茶为主要研究材料,云南... 详细信息

南昆山毛叶茶(Camellia ptilophylla Chang)是一种天然低或无咖啡碱的珍稀茶树资源,其抗癌、减肥、抗氧化等功能特性已有研究,但通过构建细胞氧化损伤模型评价其抗氧化活性的研究尚未深入,因此本研究以南昆山毛叶茶为主要研究材料,云南大叶种为对照,叔丁基过氧化氢(tert-Butyl hydroperoxide,tBHP)作为诱导剂,构建小鼠成纤维细胞NIH3T3氧化损伤模型。采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞存活率,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测细胞膜完整性。同时,检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutataione,GSH)含量、铁含量,以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)抗氧化酶活性,评价抗氧化能力,荧光探针测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)变化,微板法和蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)、caspase-9、细胞色素c的表达,以探究其氧化损伤保护机制。主要研究结果如下:(1)两品种茶叶基本理化组成经比色法和高效液相色谱等技术分析表明,南昆山毛叶茶水提物中,反式儿茶素含量高,占总儿茶素的80.70%,其中没食子儿茶素没食子酸酯含量最高,占总儿茶素的54.17%;云南大叶种茶则是顺式儿茶素含量高,占总儿茶素的70.07%,其中表没食子儿茶素没食子酸酯含量最高,占总儿茶素的23.01%。南昆山毛叶茶水提物以可可碱含量最高,占生物碱的99.92%;而云南大叶种茶水提物则以咖啡碱为主,占生物碱的83.51%。即不同于云南大叶传统品种,南昆山毛叶茶具有高反式/低顺式儿茶素,高可可碱/低咖啡碱的特殊化学组成。(2)tBHP诱导小鼠成纤维细胞NIH3T3氧化损伤模型的建立tBHP诱导NIH3T3构建的氧化损伤模型,铺板浓度为5×10cell/m L,tBHP诱导损伤剂浓度为200μmol/L,该模型在NIH3T3细胞4～22代内稳定。(3)两品种茶叶水提物抗氧化活性测定在25～100μg/m L浓度范围内,两品种茶叶水提物均对NIH3T3细胞正常生长无毒副作用。经200μmol/L的tBHP处理后,NIH3T3细胞存活率降低为54.00%,细胞形态变化,上清液中LDH含量增高至520.70 U/L。加入25～100μg/m L浓度的两品种茶叶水提物后,细胞存活率升高,LDH含量降低。且南昆山毛叶茶水提物同处理浓度下细胞存活率为云南大叶种的1.35倍,LDH含量为0.73倍,即南昆山毛叶茶细胞抗氧化活性强于云南大叶种。(4)南昆山毛叶茶对tBHP诱导NIH3T3细胞氧化损伤保护作用机理初探抗氧化系列指标表明,200μmol/L的tBHP可使NIH3T3细胞内CAT、SOD、GSH-Px抗氧化酶活力降低,细胞内铁、MDA含量增加,GSH含量降低,ROS大量蓄积,MMP降低,诱导NIH3T3细胞发生线粒体凋亡,最终导致细胞氧化损伤。而加入25～100μg/m L浓度的南昆山毛叶茶水提取物后,提高了CAT、SOD、GSH-Px酶活力,分别为tBHP组的1.42倍、1.77倍、2.48倍,降低细胞内铁和MDA含量,分别为tBHP组的0.19倍和0.02倍,GSH含量提高至tBHP组的3.07倍,减少ROS积累,维持MMP正常,抑制caspase-3、caspase-9、细胞色素c的表达。说明南昆山毛叶茶水提物能修复抗氧化系统,抑制线粒体细胞凋亡途径,有效缓细胞氧化损伤。

关键词：南昆山毛叶茶 tBHP NIH3T3 抗氧化活性

南昆山毛叶茶三种多酚的分离纯化及抗氧化、抗炎研究

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南昆山毛叶茶三种多酚的分离纯化及抗氧化、抗炎研究

作者：旷小珊华南农业大学

学位级别：硕士

为探究南昆山毛叶茶活性成分的功能特性,本研究以南昆山毛叶绿茶为材料,通过30%乙醇/乙酸乙酯提取,采用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和制备型高效液相色谱分离纯化,得到3种多酚单体物质;通过高效液相色谱-串联质谱、核磁共... 详细信息

为探究南昆山毛叶茶活性成分的功能特性,本研究以南昆山毛叶绿茶为材料,通过30%乙醇/乙酸乙酯提取,采用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和制备型高效液相色谱分离纯化,得到3种多酚单体物质;通过高效液相色谱-串联质谱、核磁共振和红外光谱鉴定单体结构;采用DPPH、ABTS、FRAP和ORAC四种化学方法、CAA法及L-O肝细胞氧化应激模型法,综合评价了3种多酚单体物质的抗氧化活性;运用小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型,通过ELISA、RT-PCR和Western blot等技术方法,探讨了南昆山毛叶茶分离得到的多酚单体物质的抗炎活性及作用机制。本研究获得主要结果如下:1.南昆山毛叶绿茶多酚组分的分离纯化和结构鉴定以南昆山毛叶绿茶为实验材料,经30%乙醇浸提、乙酸乙酯萃取后,获得30%乙醇/乙酸乙酯提取物,分离纯化得到物质1、物质2、物质3,纯度分别为98%、96%、97%,得率分别为2.45%、0.55%、0.31%。通过高效液相色谱-串联质谱、核磁共振和红外光谱鉴定组分结构,鉴定物质1为没食子儿茶素没食子酸酯(GCG),物质2为1,2,4,6-四没食子酰葡萄糖(1,2,4,6-GA-glc),物质3为儿茶素-3,5-二没食子酸酯(GC-3,5-di GA),其中后2种为茶叶中的特殊多酚物质。2.多酚单体物质的抗氧化活性研究(1)DPPH、ABTS和FRAP三种化学法的抗氧化结果基本一致:GCG>GC-3,5-di GA>1,2,4,6-GA-glc,ORAC法的结果与此相反,1,2,4,6-GA-glc的作用强于GCG和GC-3,5-di GA,综合,GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-di GA具有化学抗氧化能力,其中GCG具有较强的清除自由基能力。(2)CAA法结果显示GCG、GC-3,5-di GA和1,2,4,6-GA-glc呈剂量依赖性抑制DCF生成;在HO诱导L-O细胞氧化损伤模型中,GCG、GC-3,5-di GA和1,2,4,6-GA-glc均可显著提高细胞的存活率,降低细胞内ROS含量,抑制细胞上清中LDH的释放量。综合2种基于细胞水平上的抗氧化研究表明,这3种多酚单体物质具有良好的细胞抗氧化活性,其中1,2,4,6-GA-glc细胞抗氧化能力最强,GC-3,5-di GA次之,GCG最弱。3.多酚单体物质的抗炎活性研究(1)GCG和GC-3,5-di GA与1μg/m L的LPS混合孵育24 h后,均可显著抑制NO和PGE生成。GCG和GC-3,5-di GA抑制NO生成的IC值为92.37±10.04和58.17±3.90μg/m L,GC-3,5-di GA的抑制效果比GCG好。在100μg/m L浓度时,GCG和GC-3,5-di GA对PGE生成的抑制率分别为38.75±5.42%和24.64±2.42%。(2)在25～100μg/m L浓度范围内,GCG和GC-3,5-di GA均可随着浓度的增大而显著抑制细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10生成。(3)GCG和GC-3,5-di GA均能下调RAW264.7细胞内i NOS、COX-2、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA的转录水平。(4)GCG和GC-3,5-di GA均可下调i NOS和COX-2蛋白的表达。

关键词：南昆山毛叶茶多酚单体物质分离纯化抗氧化抗炎

南昆山毛叶茶N-甲基转移酶基因克隆与功能初步鉴定

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南昆山毛叶茶N-甲基转移酶基因克隆与功能初步鉴定

南昆山毛叶茶N-甲基转移酶基因克隆和表达研究

中国食品科学技术学会第七届年会

作者：许煜华王慧静文海涛赵亮李斌陈忠正华南农业大学食品学院

N-甲基转移酶基因（NMT）是茶叶中咖啡碱合成代谢调控的关键酶基因。本研究对南昆山毛叶茶cDNA文库筛选获得的非全长NM丁基因采用5’RACE技术,成功克隆出两个NMT基因全长,分别命名为NMT8和NMT22,cDNA长度分别为1457bp和1434bp,编码区各... 详细信息

N-甲基转移酶基因（NMT）是茶叶中咖啡碱合成代谢调控的关键酶基因。本研究对南昆山毛叶茶cDNA文库筛选获得的非全长NM丁基因采用5’RACE技术,成功克隆出两个NMT基因全长,分别命名为NMT8和NMT22,cDNA长度分别为1457bp和1434bp,编码区各长1098bp,并各编码365个氨基酸。通过基因重组技术将获得的这两个NMT基因编码区分别构建进原核表达载体pET-32a,并将构建好的pET-32a-NMT8、pET-32a-NM722表达载体利用电击转化技术分别转入大肠杆菌DE3中。实验检测表明pET-32a-NMT22靶蛋白优化的表达条件为:在37℃、IPTG浓度为1mmol/L和诱导表达6h,并可表达出约40kDa与预期融合蛋白大小一致的靶蛋白。对表达靶蛋白底物催化产物经HPLC检测表明,本实验条件下表达靶蛋白没有检测到生物碱催化活性,而pET-32a-NMT8在本实验条件下则未能表达出融合蛋白。

关键词：南昆山毛叶茶 N-甲基转移基因 RACE 基因表达

来源： cnki会议评论

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南昆山毛叶茶N-甲基转移酶基因克隆和表达研究