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生物工程学报 2004年第1期20卷 10-15页

作者：贾洪革吕玲飞庞永奇陈晓英方荣祥中国科学院微生物研究所植物生物技术实验室北京100080

绿色荧光蛋白 (GFP)可直接进行活体观察 ,它的这个优点可被用于监测转基因植物中选择标记基因的消除。为此 ,构建了植物表达载体pGNG ,将绿色荧光蛋白基因 (gfp)和卡那霉素抗性基因表达盒 (NosP nptII NosT)一起克隆在两个同向的lox位点... 详细信息

绿色荧光蛋白 (GFP)可直接进行活体观察 ,它的这个优点可被用于监测转基因植物中选择标记基因的消除。为此 ,构建了植物表达载体pGNG ,将绿色荧光蛋白基因 (gfp)和卡那霉素抗性基因表达盒 (NosP nptII NosT)一起克隆在两个同向的lox位点间 ,在第一个lox位点上游置有CaMV 35S启动子以驱动GFP表达 ,第二个lox位点下游置有不含启动子的大肠杆菌 β 葡萄糖醛酸酶 (GUS)基因。首先在含卡那霉素 (Kan)的培养基上筛选出转pGNG的烟草 ,借助绿色荧光可容易地检出表达GFP的转化体。然后用另一转化载体pCambia130 0 Cre二次转化表达GFP的转基因植物 ,利用另一选择标记基因潮霉素抗性基因 (hpt)进行筛选 ,在获得的再生植株中 ,Cre重组酶的表达消除了转化体中两lox位点间的gfp和nptII。实验结果表明可借助GFP荧光的消失 ,快速选出nptII被消除的二次转化体 ,同时GUS(作为目的蛋白 )在CaMV 35S启动子驱动下获得表达。最后利用后代的分离将hpt和cre除去。

关键词：选择标记基因转基因植物绿色荧光蛋白瞬间表达化学诱导表达

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转AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析

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北京林业大学学报 2020年第6期42卷 26-32页

作者：吴晓娟鲁俊倩常英英钟姗辰苏晓华张冰玉林木遗传育种国家重点实验室国家林业与草原局林木培育重点实验室中国林业科学研究院林业研究所北京100091

【目的】DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记,在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要作用。本研究将拟南芥去甲基化基因AtDME1导‘84K’杨基因组中,通过化学诱导表达实验,研究AtDME1基因在转基因杨树中的诱导表达特性,为建立杨树甲... 详细信息

【目的】DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记,在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要作用。本研究将拟南芥去甲基化基因AtDME1导‘84K’杨基因组中,通过化学诱导表达实验,研究AtDME1基因在转基因杨树中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系,进而实现杨树品种改良等奠定良好基础。【方法】以白杨派优良品种84K杨无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtDME1基因导入‘84K’杨;经过潮霉素筛选、常规PCR检测及DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理,处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h,采用qRT-PCR检测处理叶片中外源基因AtDME1的表达量变化。【结果】本研究中,潮霉素分化筛选共获得了抗性芽224个,经生根筛选获得6株抗性植株,经分子检测证实这6株抗性植株均为转AtDME1基因植株,扩繁后分别标号为转基因AD-1~6。qRT-PCR检测结果显示,化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因AtDME1的表达量基本达到最大值,效果持续至12 h后逐渐减弱。【结论】化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtDME1基因的表达,为进一步研究DME1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础,也为杨树化学诱导表达特性的研究做好了铺垫。

关键词： 84K杨转基因植株去甲基化基因化学诱导表达

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AtMET1基因在84K杨中的遗传转化及诱导表达分析

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林业科学研究 2020年第3期33卷 63-69页

作者：吴晓娟鲁俊倩常英英钟姗辰苏晓华张冰玉林木遗传育种国家重点实验室国家林业和草原局林木培育重点实验室中国林业科学研究院林业研究所北京100091

[目的]研究拟南芥甲基化转移酶基因AtMET 1在银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa ‘84K’)中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系、进而实现杨树品种改良等奠定基础。[方法]以白杨派优良品种84K杨的无菌苗叶片为受体材料,... 详细信息

[目的]研究拟南芥甲基化转移酶基因AtMET 1在银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa ‘84K’)中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系、进而实现杨树品种改良等奠定基础。[方法]以白杨派优良品种84K杨的无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtMET1基因导入84K杨基因组中;经潮霉素筛选获得抗性植株,通过常规PCR检测、DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理,处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外源基因AtMET1表达量变化。[结果]本研究共获得了潮霉素抗性芽648个,经生根筛选获得18株抗性植株,经分子检测证实全部为转基因植株,分别标号为AM-1~18#。qRT-PCR结果显示:化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因AtMET1的表达量即达到最大值,随后在处理6 h时表达量下降,处理12 h时有所回升,处理24 h后表达量降低至不足12 h时的一半。[结论]化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtMET1基因的表达,为进一步研究MET1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础,也为今后杨树化学诱导表达研究及品种改良提供新思路、新方法。

关键词：甲基化基因 84K杨转基因植株 17-β-雌二醇化学诱导表达

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转AtMET1/AtDME基因84K杨的获得及雌激素诱导表达

转AtMET1/AtDME基因84K杨的获得及雌激素诱导表达

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作者：吴晓娟中国林业科学研究院

学位级别：硕士

DNA甲基化修饰是一种重要的表观遗传修饰,在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要的作用。植物基因组DNA甲基化的水平主要是由DNA甲基转移酶类和DNA去甲基化酶类协同调控,使植物在不同发育时期、不同环境条件下呈现动态的DNA甲基化... 详细信息

DNA甲基化修饰是一种重要的表观遗传修饰,在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要的作用。植物基因组DNA甲基化的水平主要是由DNA甲基转移酶类和DNA去甲基化酶类协同调控,使植物在不同发育时期、不同环境条件下呈现动态的DNA甲基化水平。研究表明,植物基因组中有多个基因参与DNA的甲基化、去甲基化过程,其中,DNA甲基转移酶MET1(Methytransferase1)的主要功能是维持对称性CG位点的甲基化;转葡糖基酶(DEMETER,DME)能通过切除5-甲基胞嘧啶(5C)来催化DNA去甲基化。本研究以白杨派优良品种84K杨(Populus alba×***‘84K’)为试验材料,将化学诱导启动子及其调控下的拟南芥甲基化/去甲基化关键基因——甲基转移酶基因At MET1、转葡糖基酶基因At DME分别导入84K杨基因组中,获得转基因植株,通过化学诱导剂17-β-雌二醇的处理实现目的基因的人为控制表达,并诱导其叶片再生获得了一系列表型变异的84K杨群体。论文主要研究结果如下:1.通过农杆菌介导的遗传转化,获得了18个转At MET1的84K杨株系。以84K杨无菌苗叶片为材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与拟南芥甲基化转移酶基因At MET1导入84K杨基因组中,共获得了潮霉素抗性芽648个,经生根筛选获得有18株抗性植株,经PCR、DNA测序等方法检测,证实全部为转基因植株(AM-1～18#)。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行化学诱导处理,q RT-PCR结果显示,化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因At MET1的表达量即达到最大值,随后在6 h时表达量下降,12 h时有所回升,24 h以后表达量降低至不足12 h时的一半。说明化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中At MET1的表达,为进一步研究MET1在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础。2.通过农杆菌介导的遗传转化,获得了6个转At DME的84K杨株系。以84K杨无菌苗叶片为材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与拟南芥去甲基化基因At DME导入84K杨基因组中,共获得了潮霉素抗性芽224个,经生根筛选获得6株抗性植株,经过PCR及DNA测序等方法检测,证实全部为转基因植株(AD-1～6#)。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行化学诱导处理,q RT-PCR结果显示,化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因At DME的表达量基本达到最大值,效果持续至12 h后逐渐减弱。说明化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中At DME的表达,为进一步研究DME在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础。3.通过雌激素处理获得了转At MET1表型变异群体。将雌二醇处理不同时间的叶盘转移至分化培养基中,培养获得再生芽140个,生根培养后获得88株再生植株,其中0 h处理获得35株,3 h处理获得17株,6 h处理获得7株,12 h处理获得9株,24 h处理获得7株,48 h处理获得5株,96 h处理获得5株,144 h处理获得3株,扩繁后总计获得192株。取诱导处理3、12、24 h叶盘获得的再生植株,以及未诱导的转基因对照、非转基因对照,移栽至全自动日光温室,测定其生理生化指标。结果表明,转At MET1植株叶片处理后再生植株与非转基因对照相比,12 h处理株系2的苗高极显著低于对照;3个处理均有株系的叶长宽比、Pn、Gs以及可溶性蛋白含量极显著低于对照;12、24 h处理有株系的Ci显著低于对照,可溶性糖含量显著高于对照;而3 h处理株系2的Tr极显著低于对照,WUE极显著高于对照,处理3、12 h有株系的POD酶活性显著高于对照,其他差异均不显著。4.通过雌激素处理获得了转At DME表型变异群体。将雌二醇处理不同时间的叶盘转移至分化培养基中,培养获得再生芽188个,生根培养后获得141株再生植株,其中0h处理获得40株,3 h处理获得15株,6 h处理获得15株,12 h处理获得16株,24 h处理获得18株,48 h处理获得16株,96 h处理获得13株,144 h处理获得8株,扩繁后总计获得227株。取诱导处理3、12、24 h叶盘获得的再生植株,以及未诱导的转基因对照、非转基因对照,移栽至温室,测定其生理生化指标。结果表明,转At DME植株叶片诱导表达再生植株与非转基因对照及转At DME诱导0 h植株相比,3个处理都有株系的叶长宽比、Gs、Ci、Tr以及可溶性蛋白含量极显著低于对照,相对叶绿素含量、WUE和保护酶活性显著高于对照;处理3、12 h有株系的Pn极显著高于对照,处理3、24 h均有株系的可溶性糖含

关键词： P.alba×P.glandulosa‘84K’ AtMET1 AtDME 遗传转化化学诱导表达

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