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自噬在氯化镉诱导小鼠初级精母细胞凋亡中的作用

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卫生研究 2023年第3期52卷 489-496页

作者：张玲王一翔易玲娜黄鼎宇张宇倩库努都孜阿依·米尔卡米程意任全龙武汉科技大学医学院公共卫生学院湖北省职业危害识别与控制重点实验室武汉430065

目的探究自噬在氯化镉(cadmium chloride,CdCl_(2))诱导小鼠初级精母细胞(GC-2 spd)凋亡中的作用及其潜在作用机制。方法以不同浓度CdCl_(2)(0、5和10μmol/L)染毒GC-2 spd细胞24 h。Hoechst33342染色法和单丹磺酰戊二胺法分别检测凋亡... 详细信息

目的探究自噬在氯化镉(cadmium chloride,CdCl_(2))诱导小鼠初级精母细胞(GC-2 spd)凋亡中的作用及其潜在作用机制。方法以不同浓度CdCl_(2)(0、5和10μmol/L)染毒GC-2 spd细胞24 h。Hoechst33342染色法和单丹磺酰戊二胺法分别检测凋亡小体和自噬体;TUNEL荧光染色检测细胞凋亡情况;在不含/含CdCl_(2)(10μmol/L)的细胞培养液中分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(60μmol/L)、凋亡抑制剂胱天蛋白酶家族抑制剂(50 nmol/L)、自噬激动剂雷帕霉素(50 nmol/L)和溶酶体抑制剂氯喹(10μmol/L)处理GC-2 spd细胞24 h,Western blot检测细胞内自噬相关蛋白LC3、P62以及促凋亡蛋白cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的表达水平。结果CdCl_(2)染毒细胞24 h后,自噬体聚集且凋亡细胞增多。Western blot结果显示,5和10μmol/L CdCl_(2)染毒组LC3II/LC3I蛋白表达水平与对照组(5.50±0.56)相比分别升高为9.23±0.81和12.15±0.80(P0.05)。与CdCl_(2)组相比,RAPA能增强CdCl_(2)诱导的LC3II/LC3I、LC3II和P62蛋白表达水平,分别为2.22±0.21(CdCl_(2)组为1.56±0.06)、3.72±0.21(CdCl_(2)组为2.97±0.15)和2.41±0.19(CdCl_(2)组为1.52±0.35)(P值均初级精母细胞发生凋亡。

关键词：镉小鼠初级精母细胞自噬通量凋亡

微管蛋白TUBB4B在小鼠初级精母细胞GC-2中的作用和分子机制的初步研究

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作者：刘桐佳内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的:细胞骨架中的微管蛋白在睾丸发育和精子发生中发挥重要作用。本研究探索微管蛋白TUBB4B(tubulinβ-4b chain,也称作Tubulinβ-2C)在初级精母细胞发育过程中的作用和调控机制。方法通过慢病毒介导的基因编辑技术,获得Tubb4b基因敲... 详细信息

目的:细胞骨架中的微管蛋白在睾丸发育和精子发生中发挥重要作用。本研究探索微管蛋白TUBB4B(tubulinβ-4b chain,也称作Tubulinβ-2C)在初级精母细胞发育过程中的作用和调控机制。方法通过慢病毒介导的基因编辑技术,获得Tubb4b基因敲减和过表达的小鼠初级精母细胞GC-2。在Tubb4b敲减和过表达的GC-2细胞,以及胞浆羧肽1(Cytosolic carboxypeptidase-like 1,CCP1)敲减和回复表达的GC-2细胞中,用实时荧光定量PCR(Reverse transcription Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测Tubb4b与CCP1表达水平的变化,通过细胞计数实验(cell counting kit-8,CCK8)和流式细胞术检测Tubb4b敲减和过表达对GC-2细胞增殖和周期的影响,并通过RT-qPCR检测细胞周期因子的表达,应用Western bolt和细胞免疫荧光实验检测核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)与丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路因子的表达。使用转录组学测序筛选Tubb4b敲减后GC-2细胞中差异表达的基因,并利用生物信息学手段对差异基因的功能和可能参与的信号通路进行富集分析,利用RT-qPCR对差异表达基因进行验证。结果慢病毒介导的siRNA-Tubb4b感染GC-2后,与阴性对照组相比,Tubb4b和CCP1在mRNA和蛋白水平上的表达均显著降低(P细胞中Tubb4b的表达随着CCP1表达的降低而降低(P细胞增殖实验发现Tubb4b敲减和过表达对GC-2的增殖没有显著影响,流式细胞术发现Tubb4b敲减和过表达的GC-2细胞的周期与对照组相比无明显改变;RT-qPCR检测发现Tubb4b敲减后CDK-1、CDK-2、Cyclin B1、Cyclin D1表达显著升高(P细胞中NF-κB信号通路关键蛋白P65的表达显著降低(P0.05);MAPK信号通路关键蛋白ErK1/2、P38无明显变化,磷酸化的p-ErK1/2表达水平显著升高(P细胞中P38、ErK1/2表达无明显变化,P65、p-P65、PolyE表达明显升高(P细胞水平中的表达位置;通过转录组学测序发现Tubb4b沉默后共有1328个基因的表达上调,562个基因表达下调生信分析发现参与了胞外基质,胞外间隙,细胞粘附,生物附着,细胞迁移,神经活性配体-受体代谢,轴突导向等过程;功能富集发现:与肿坏死因子信号通路,肿瘤/癌症代谢通路以及钙离子信号通路等高度相关;最后通过RT-qPCR发现Cadm1、Armcx4、Lama5、Dync2h1等与雄性不育相关的基因在Tubb4b敲减后表达明显降低(P初级精母细胞GC-2细胞中TUBB4B与CCP1表达相互调控互为正向作用,而且CCP1可能通过对其羧基端或者侧链末端的多聚谷氨酸进行剪切,从而影响Tubb4b的转录、翻译以及翻译后修饰;Tubb4b表达的降低可以调控NF-κB和MAPK信号通路并影响Cadm1、Armcx4、Lama5、Dync2h1等多个雄性生殖相关基因的表达。

关键词：雄性不育 CCP1 Tubb4b 初级精母细胞 NF-κB通路 MAPK通路转录组学

SCP3作为栉孔扇贝初级精母细胞标记分子的研究

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水产学报 2017年第7期41卷 1096-1104页

作者：马晓世杨丹丹季爱昌梁少帅马晓茹张志峰中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室

为检验SCP3在无脊椎动物中是否可以标记特定的生殖细胞,实验利用RACE技术克隆了栉孔扇贝SCP3(Cf-SCP3)的全长cDNA序列,结果显示,其长度为1 033 bp,开放阅读框为726 bp,编码241个氨基酸。推导的氨基酸序列中包含SCP3保守的Cor1结构域和... 详细信息

为检验SCP3在无脊椎动物中是否可以标记特定的生殖细胞,实验利用RACE技术克隆了栉孔扇贝SCP3(Cf-SCP3)的全长cDNA序列,结果显示,其长度为1 033 bp,开放阅读框为726 bp,编码241个氨基酸。推导的氨基酸序列中包含SCP3保守的Cor1结构域和卷曲螺旋结构域。制备了Cf-SCP3地高辛标记的RNA探针和Cf-SCP3重组蛋白的多克隆抗体,采用原位杂交和免疫组织化学技术检测其细胞学定位,结果显示Cf-SCP3转录本和Cf-SCP3蛋白均特异性地定位在栉孔扇贝的初级精母细胞和未受精卵中,在精巢的其他类型细胞和卵巢中均未见表达信号。研究表明,Cf-SCP3蛋白可能与脊椎动物的SCP3蛋白一样,作为联会复合体的组成成分参与栉孔扇贝的配子发生,同时可以作为一个栉孔扇贝初级精母细胞的分子标记应用到体外诱导生殖细胞分化的研究。

关键词：栉孔扇贝 SCP3 初级精母细胞未受精卵减数分裂

电镜下识别不同发育阶段猕猴精原细胞和初级精母细胞

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Current Zoology 1981年第4期27卷 342-344+409-410页

作者：杨勇正中国科学院生物物理研究所

运用放射自显影技术,对哺乳动物精子发生动力学的研究;在大白鼠中,A型精原细胞再分为A;型和A;至A;型等5种细胞（Clermont等,1968、1975）。在猕猴中,A型精原细胞再分为暗A型和淡A型精原细胞;B型精原细胞又有B;、B;、B;和B;型细胞之分（C... 详细信息

运用放射自显影技术,对哺乳动物精子发生动力学的研究;在大白鼠中,A型精原细胞再分为A;型和A;至A;型等5种细胞（Clermont等,1968、1975）。在猕猴中,A型精原细胞再分为暗A型和淡A型精原细胞;B型精原细胞又有B;、B;、B;和B;型细胞之分（Clermont,1969;Clermont等,1973）。但试图从形态上,较为精确地识别不同发育阶段的精原细胞,不但在光学显微镜下,即使在电镜下也存在困难。有人认为,超薄切片太薄,电镜下显示的胞核结构差异太小。Cavicchia等（1978）和Dym等（1978）首先在电镜

关键词：精原细胞电子密度电子浓度初级精母细胞不同发育阶段电子显微镜电镜

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小鼠初级精母细胞带下受精的研究

科学通报 1997年第13期42卷 1432-1436页

作者：刘灵钱菊汾孙青原段崇文刘辉宋祥芬陈大元西北农业大学动物医学系杨陵712100 中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室北京100080

众所周知,只有精子才能主动穿透卵子,使卵子受精,而变态前的睾丸生精细胞不能主动地使卵子受精。显微受精技术的发展使得变态前的睾丸生精细胞参与受精成为可能。1993年,Ogura首次将仓鼠球形精子细胞核注入成熟卵母细胞中,发现精核可以... 详细信息

众所周知,只有精子才能主动穿透卵子,使卵子受精,而变态前的睾丸生精细胞不能主动地使卵子受精。显微受精技术的发展使得变态前的睾丸生精细胞参与受精成为可能。1993年,Ogura首次将仓鼠球形精子细胞核注入成熟卵母细胞中,发现精核可以发育形成具有DNA合成活性的雄原核,并最终能与卵母细胞雌原核接合。

关键词：初级精母细胞带下受精电融合受精减数分裂

小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变的意义和构型过程

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卫生研究 1995年第S2期24卷 41-44页

作者：姚小曼北京市卫生防疫站毒理科

初级精母细胞染色体受损伤，其三价体、四价体的形成必须经过ＤＮＡ复制使损伤插入到ＤＮＡ中才能形成多价体，了解此构型过程对正确诊断畸变类型颇有帮助。

关键词：初级精母细胞染色体四价体

1,1-二氨基-2,2-二硝基乙烯急性染毒对小鼠初级精母细胞染色体畸变的影响

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环境与健康杂志 2018年第7期35卷 635-636,F0003页

作者：高永超王鸿孙超刘志永岳红夏洁芳牛浩高俊宏兵器工业卫生研究所生物效应与毒理研究室陕西西安710065 第四军医大学第一附属医院妇产科生殖医学中心

为评价1,1-二氨基-2,2-二硝基乙烯(FOX-7)对小鼠初级精母细胞染色体畸变的影响,将50只健康7-12周龄SPF级雄性昆明小鼠随机分为5组,分别为溶剂对照(4%淀粉溶液)组和348.22、139.29、69.64mg/kg FOX-7染毒组,另设阳性对照(40mg/kg环磷酰胺... 详细信息

为评价1,1-二氨基-2,2-二硝基乙烯(FOX-7)对小鼠初级精母细胞染色体畸变的影响,将50只健康7-12周龄SPF级雄性昆明小鼠随机分为5组,分别为溶剂对照(4%淀粉溶液)组和348.22、139.29、69.64mg/kg FOX-7染毒组,另设阳性对照(40mg/kg环磷酰胺)组,每组10只。每日固定时间采用经口灌胃方式进行染毒,染毒容量为20ml/kg,连续5d。于首次染毒后第12天,观察染色体结构畸变率和单价体率。结果显示,与溶剂对照组比较,348.22mg/kg FOX-7染毒组小鼠初级精母细胞染色体结构畸变率较高,差异有统计学意义(P初级精母细胞常染色体单价体和性染色体单件体率均无明显改变。提示FOX-7可能会引起小鼠初级精母细胞染色体发生结构畸形改变。

关键词： 1 1-二氨基-2 2-二硝基乙烯(FOX-7) 初级精母细胞染色体畸变

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哺乳动物初级精母细胞体外培养的研究

广西医科大学学报 2006年第3期23卷 391-393页

作者：檀大羡刘锋王植柔卢晟盛李莲军卢克焕广西医科大学附属肿瘤医院泌尿外科广西医科大学第三附属医院广西大学动物繁殖研究所

目的:探讨哺乳动物初级精母细胞体外培养分化的可能性。方法:制备雄性大鼠睾丸初级精母细胞,与非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)共培养,观察初级精母细胞体外培养过程中的生长行为,用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记跟踪观察大鼠初级精母细胞在... 详细信息

目的:探讨哺乳动物初级精母细胞体外培养分化的可能性。方法:制备雄性大鼠睾丸初级精母细胞,与非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)共培养,观察初级精母细胞体外培养过程中的生长行为,用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记跟踪观察大鼠初级精母细胞在体外培养中的分化情况。结果:大鼠初级精母细胞与Vero细胞共培养后能进行减数分裂阶段分化,生成精子细胞;BrdU标记检测结果显示,培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞,培养后在有BrdU标记的细胞中有早期精子细胞。结论:哺乳动物初级精母细胞在体外培养中能进行分化。

关键词：初级精母细胞体外培养 Vero细胞大鼠

犏牛与牦牛初级精母细胞全基因组甲基化比较研究

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犏牛与牦牛初级精母细胞全基因组甲基化比较研究

作者：罗辉西南科技大学

学位级别：硕士

犏牛是公黄牛和母牦牛的种间F1代杂种,在生产性能和对青藏高原恶劣环境适应能力方面均具有显著的杂种优势,对提升牦牛生产性能发挥着重要作用,但公犏牛由于精子发生阻滞而不育,成为牦牛杂交育种的最大障碍。精子发生中,异常的DNA甲基化... 详细信息

犏牛是公黄牛和母牦牛的种间F1代杂种,在生产性能和对青藏高原恶劣环境适应能力方面均具有显著的杂种优势,对提升牦牛生产性能发挥着重要作用,但公犏牛由于精子发生阻滞而不育,成为牦牛杂交育种的最大障碍。精子发生中,异常的DNA甲基化会导致基因表达紊乱,造成生精阻滞甚至不育。本研究在单细胞、单碱基水平对犏牛及牦牛初级精母细胞全基因组甲基化进行了全面的分析,得出结论如下:（1）首次通过犏牛及牦牛初级精母细胞单细胞全基因组DNA甲基化测序分析,发现犏牛与牦牛初级精母细胞的表观基因组组成及模式截然不同:犏牛基因组整体CG及non-CG位点甲基化水平均高于牦牛,且犏牛精母细胞基因组内总的甲基化C位点也多于牦牛。犏牛与牦牛初级精母细胞全基因组DNA甲基化在全染色体水平具有显著差异:犏牛中几乎所有染色体中都具有高水平且高密度的DNA甲基化分布,但牦牛中一些染色体的某些区域出现DNA甲基化缺失（染色体1,2,4,6,10,22,23,X）。（2）犏牛初级精母细胞中许多减数分裂、piRNA通路（SYCE1/3,SYCP3,RAD51,RAD51C,XRCC1/2,MOV10L1,MAEL,PIWIL1/2,DDX4,FKBP6,SPACA1,TEX29,TDRD6/9,PRDM1/15,和PLD6）等生精特异性基因呈启动子高甲基化,且这些基因的表达相比于牦牛呈显著下调,表明这些减数分裂相关基因的启动子DNA高甲基化通过抑制基因的表达,导致联会复合体不能正确组装及DSB修复异常,进而引起减数分裂阻滞和犏牛雄性不育。（3）犏牛精原细胞仅在外源性高浓度维甲酸处理时才对其做出响应,且精原细胞分化相关基因（MEIOSIN、SOHLH2、STRA8和C-KIT）在维甲酸刺激后有显著变化,但这并不足以促进减数分裂的正常启动,预示着启动减数分裂这一过程在犏牛精原细胞中也存在较大的缺陷。综上所述,本研究采用单细胞全基因组甲基化测序、免疫荧光、亚硫酸氢盐测序、RT-qPCR等技术对犏牛及牦牛初级精母细胞甲基化组进行了全面的解析,发现多个减数分裂及piRNA通路特异性基因呈启动子高甲基化,还表明犏牛精原细胞仅在外源性高浓度维甲酸处理时才对其做出响应。总的来说,本研究为解析犏牛雄性不育的分子机制提供了丰富的科学依据。

关键词：犏牛雄性不育初级精母细胞单细胞全基因组DNA甲基化测序