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抗融合标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

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抗融合标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

作者：户义中国人民解放军第四军医大学

学位级别：硕士

融合蛋白(fusion protein)是将两个或两个以上的基因通过一定方式连接在一起共同表达出的重组蛋白。标签融合蛋白(tag fusion protein)是融合蛋白的一种，它是由目的蛋白(target protein)和融合标签(fusion tag)共同构成的蛋白嵌合体。... 详细信息

融合蛋白(fusion protein)是将两个或两个以上的基因通过一定方式连接在一起共同表达出的重组蛋白。标签融合蛋白(tag fusion protein)是融合蛋白的一种，它是由目的蛋白(target protein)和融合标签(fusion tag)共同构成的蛋白嵌合体。常见的融合标签包括：多聚组氨酸(poly-His)、FLAG多肽、葡萄球菌蛋白A(SPA)、免疫球蛋白的Fc段以及谷胱甘肽转移酶(GST)等。融合标签的使用不仅方便了目的蛋白的表达和纯化，同时为目的蛋白结构和功能的研究提供了便利手段。随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的完成，后基因组学(post-genomics)和蛋白质组学(proteomics)已经成为生命科学发展的重点，这一时期，科学家面临的最大挑战是在整体水平上系统地、综合地研究蛋白质的结构、功能以及蛋白质与蛋白质、核酸等生物大分子之间的相互作用。蛋白质的表达和纯化是蛋白质研究的关键环节。与标签蛋白融合表达提供了一个高通量(high-through)表达和筛选功能蛋白的平台，因而为学者广泛重视，已成为一条联系基因组和蛋白质组的重要纽带。另外，融合蛋白在蛋白复合物的分离、药物筛选以及临床治疗等领域也发挥着重要作用。单克隆抗体技术是1975年由Khler和Milstein共同创立的用于生产针对单一表位抗体的免疫学技术。由于单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、少或无交叉反应等优点，被广泛应用于生命科学的各个领域。在蛋白质组学的研究中，针对融合标签的单克隆抗体不但可以作为亲和层析介质对融合蛋白进行分离和纯化，还可以方便地研究目的蛋白质的分布和功能，是后基因学研究的重要工具。一本实验中，我们制备了7株稳定分泌抗Ig融合蛋白FC段单克隆抗体的杂交瘤细胞株FMUI7CI～7，其中FMUFCZ、F刚FC4、FMUFCS和F删FC6 为 IgGI（K）;FMUFCI、F删FC3及 FMwC7为 IgGZb（K）。7株 InAb所未腹水效价为在 0．5～IXIO－’，酶标 a效价为在 10叫～10刁。竞争 ELISA u 生物传感器分析表明，获得的7株单克隆抗体识别7个不同的表位，其中 FMUFCS、FMUFC6和FMUFC3的表位比较接近，FMUF。2和FMU’FC4的表位相差最远。在表位分析的基础上，我们利用FMUFC4作为包被抗体， H肚F 作为酶标记抗体，构建了用于检测Ig融合蛋白的双单抗夹心 ELISA系统，并通过选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度对其进行了优化。敏感性与特异性试验表明该系统的检测水平达到Zv叭且与其它物种的IgG没有交叉反应。利用该系统对COS河细胞表达的LAIRl工g融合蛋白和抗Notch配体Deftal的嵌合抗体进行了测定，均获得浓度依赖的A 值曲线。这表明，该夹心ELISA系统能够用于细胞培养上清中的Ig融合蛋白和嵌合抗体水平的检测。有趣的是尽管 F则FC3、FMUFCS和 F刚FC6 的表位非常接近，但在免疫印迹只有FMUFC6可同时用于Ig融合蛋白和 hlgG的免疫印迹检测，提示在蛋白质变性过程中，随着蛋白质空间结构的破坏，许多抗体识别的表位会消失或减弱，进一步说明抗原抗体之间的特异性反应有赖于抗原和抗体分子在空间结构上的识别，而不仅仅取决于氨基酸在蛋白质中的线性排列。利用 FMUFCS InAb制备的亲和层析柱，对转染后COS河细胞培养上清的LAIR1 融合蛋白进行纯化，纯化产物经 ***后显示层析所得蛋白质的分子量与理论值相符，纯度大于 80％。这说明免疫亲和层析能够有效的纯化培养基中的Ig融合蛋白，为Ig融合蛋白纯化提供了新的有效途径。另外，我们对我室制备的5株抗GST、5株抗m 和 1株抗FLAG单克隆抗体进行了比较系统的鉴定，并对其中部分单克隆抗体进行了初步应用研究。结果表明除抗FLAG单克隆抗体的腹水效价较低，不能用于相应融合蛋白的免疫印迹外，其他 10株单克隆抗体的腹水效价均在 10’～10’之间，并且全部可以用于相应融合蛋白的免疫印迹检测。比较发现，抗His标签的单克隆抗体制备的亲和层析柱对m 融合蛋白的纯化效果优于以 N iu十TA 为基质的金属亲和层析。 FasL是重要的凋亡诱导配体（poptosis inducing ligand，AIL），在免疫防御和免疫自稳中发挥着重要作用。FasL抗原以及抗 FasL ti体在基础和临床研究中有巨大的应用价值。我们采用基因工程技术，构建并表达了人FasL 胞膜外区与GST的融合蛋白并利用抗GST和抗hFasL的单克隆抗

关键词：标签融合蛋白融合标签 Ig融合蛋白单克隆抗体免疫印记 ELISA 亲和层析凋亡诱导配体

11q23异常小儿急性淋巴细胞白血病细胞对TRAIL的敏感性研究

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宁夏医科大学学报 2010年第7期32卷 777-782页

作者：陈诚施森张晓春宁夏医科大学银川750004 宁夏医科大学附属医院儿科银川750004

目的观察11q23异常小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞对肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)所介导的细胞毒的敏感性,并探讨其机制。方法以11q23异常ALL细胞株3株及原代细胞为研究对象,通过测定细胞表面TRAIL受体表达、TRAIL作... 详细信息

目的观察11q23异常小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞对肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)所介导的细胞毒的敏感性,并探讨其机制。方法以11q23异常ALL细胞株3株及原代细胞为研究对象,通过测定细胞表面TRAIL受体表达、TRAIL作用后细胞的存活率及凋亡,观察11q23异常ALL对TRAIL的敏感性。结果除KOCL33对TRAIL部分敏感外,KOCL69、KOPB26及原代细胞对TRAIL高度耐受。原代细胞及3个细胞株DR4均呈阴性,DR5在KOCL33呈强阳性,而在其他细胞株呈阴性,原代细胞及3个细胞株均未表达DcR1及DcR2。结论 11q23异常ALL细胞对TRAIL耐受的原因可能是细胞表面凋亡受体表达低下,并有可能是小儿11q23异常ALL迅速克隆扩增及GVL效应差的重要机制之一。

关键词： 11q23 急性淋巴细胞白血病凋亡诱导配体

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肿瘤学

中国医学文摘（老年医学） 2005年第1期14卷 35-52页

老年心力衰竭患者血浆可溶性TRAIL和受体DR5水平的变化

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心脏杂志 2003年第2期15卷 118-120页

作者：洪燕李源王晓明李影娜欧阳为明金伯泉武警江西总队医院江西南昌330001 第四军医大学西京医院老年病科陕西西安710032 第四军医大学免疫学教研室陕西西安710032

目的 :观察老年充血性心力衰竭 (CHF)患者血浆可溶性 TNF相关的凋亡诱导配体 (s TRAIL)、死亡受体(s DR5 )水平与心功能状态的关系。方法 :用酶联免疫吸附法 (EL ISA)检测 4 1例老年 CHF患者和 2 0例健康老年人(对照组 )血浆 s TRAIL 和... 详细信息

目的 :观察老年充血性心力衰竭 (CHF)患者血浆可溶性 TNF相关的凋亡诱导配体 (s TRAIL)、死亡受体(s DR5 )水平与心功能状态的关系。方法 :用酶联免疫吸附法 (EL ISA)检测 4 1例老年 CHF患者和 2 0例健康老年人(对照组 )血浆 s TRAIL 和 s DR5水平 ,用多普勒超声心动图测定 CHF患者左室射血分数 (L VEF)。结果 :1CHF患者血浆 s TRAIL 水平较健康对照组升高 (1.4 5± 0 .5 2 ng· m L- 1 vs0 .93± 0 .12 ng· m L- 1 ,P>0 .0 5 ) ;CHF患者血浆 s DR5水平 (41± 8pg· m L- 1 )较对照组 (<6 pg· m L- 1 )明显升高 ,且随心功能损害程度加重而升高 ,心功能级者显著高于 , 级 (P<0 .0 5 ,P<0 .0 1)。 2 L VEF和 s DR5水平呈显著的负相关 (r=- 0 .5 2 ,P<0 .0 1) 3高血压心脏病 CHF患者血浆 s DR5水平明显高于其它病因 CHF患者。结论 :血浆 s DR5水平可能是反映老年

关键词：心力衰竭充血性酶联免疫吸附法凋亡诱导配体死亡受体老年人

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TRAIL与肿瘤治疗

中国肿瘤生物治疗杂志 2001年第2期8卷 157-159页

作者：常卫红国家药品监督管理局药品审评中心北京100050

TRAIL是近年来发现的又一凋亡分子 ,它的只诱导肿瘤细胞凋亡而不对机体正常组织产生毒性效应的特征使其在肿瘤的免疫治疗中具有潜在的应用前景。然而将TRAIL应用于临床还需要对其作用机制、抗瘤效应、以及毒性等方面进行深入探索。本文... 详细信息

TRAIL是近年来发现的又一凋亡分子 ,它的只诱导肿瘤细胞凋亡而不对机体正常组织产生毒性效应的特征使其在肿瘤的免疫治疗中具有潜在的应用前景。然而将TRAIL应用于临床还需要对其作用机制、抗瘤效应、以及毒性等方面进行深入探索。本文介绍了TRAIL对肿瘤细胞的凋亡诱导的作用机制 ,和国外对TRAIL的体内外抗瘤实验观察 ,联合化疗等效应以及TRAIL可能存在的潜在毒性。

关键词： TNF 凋亡诱导配体 TRAIL 肿瘤治疗

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TRAIL促胃癌细胞凋亡作用研究

TRAIL促胃癌细胞凋亡作用研究

鼻咽癌组织细胞死亡受体DR4和DR5 mRNA的表达

第八届中国肿瘤学术大会暨第十三届海峡两岸肿瘤学术会议

作者：李琳范彪文贤子季加孚北京大学肿瘤医院恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室北京大学肿瘤医院胃肠肿瘤外科

＜正＞目的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常组织细胞无明显毒性的特性,在肿瘤靶向治疗中极具应用前景。本研究通过体内体外实验评价TRAIL通路在胃癌中诱导凋亡的敏感性。方法选取9株胃癌细胞... 详细信息

＜正＞目的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常组织细胞无明显毒性的特性,在肿瘤靶向治疗中极具应用前景。本研究通过体内体外实验评价TRAIL通路在胃癌中诱导凋亡的敏感性。方法选取9株胃癌细胞系和1株永生化胃上皮细胞系进行实验,qRT-PCR

关键词：胃癌细胞凋亡诱导配体信号通路敏感性分析

来源： cnki会议评论

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中国耳鼻咽喉颅底外科杂志 2001年第4期7卷 229-231,216页

作者：王光平王行炜王承龙中南大学湘雅医院中心实验室湖南长沙410008 中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科湖南长沙410008

目的　分析鼻咽癌 (NPC)组织细胞死亡受体 (deathreceptor ,DR)DR4和DR5mRNA的表达。方法从NPC癌组织提取的细胞总RNA逆转录生成第一条cDNA链后 ,再用DNA多聚酶链式反应扩增。经电泳、溴乙锭染色后 ,分析DR4和DR5受体mRNA的表达。结果... 详细信息

目的　分析鼻咽癌 (NPC)组织细胞死亡受体 (deathreceptor ,DR)DR4和DR5mRNA的表达。方法从NPC癌组织提取的细胞总RNA逆转录生成第一条cDNA链后 ,再用DNA多聚酶链式反应扩增。经电泳、溴乙锭染色后 ,分析DR4和DR5受体mRNA的表达。结果　 2 0例NPC癌组织有 12例可检测到DR4mRNA的表达 ,表达阳性率为 6 0 %。而所有 2 0例NPC癌组织均可检测到DR5mRNA的表达。 8例非NPC鼻咽组织也都可检测到DR5mRNA的表达 ,但未能检测到DR4mRNA的表达。结论　DR4受体mRNA在NPC癌组织与非NPC鼻咽组织之间表达不同 ,而DR5受体mRNA在NPC癌组织与非NPC鼻咽组织之间的表达无差别 ,提示DR4和DR5死亡受体在NPC癌组织与非NPC鼻咽组织可能起着不同的作用。

关键词：鼻咽肿瘤遗传学凋亡诱导配体死亡受体细胞凋亡基因表达

急性呼吸窘迫综合征患者肺泡灌洗液细胞凋亡的研究

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中国危重病急救医学 2008年第1期20卷 64-64页

作者：包呈梅(编译) 胡森(审校)

细胞凋亡被认为在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发展中起着重要作用。韩国科研人员对31例ARDS患者肺泡灌洗液中细胞凋亡进行了研究，对照组为20例健康成年人。用酶联免疫吸附法（EusA）检测肺泡灌洗液中细胞角蛋白（CK-18）、自细胞介... 详细信息

细胞凋亡被认为在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发展中起着重要作用。韩国科研人员对31例ARDS患者肺泡灌洗液中细胞凋亡进行了研究，对照组为20例健康成年人。用酶联免疫吸附法（EusA）检测肺泡灌洗液中细胞角蛋白（CK-18）、自细胞介素-8（IL-8）、可溶性脂肪酸（sFas）、可溶性脂肪酸配体（sFasL）、癌生长基因-α（GRO—α）、粒细胞集落刺激因子（G—CSF）、肿瘤坏死因子-α（TNF—α）相关细胞凋亡诱导配体（TRAIL）的含量。

关键词：急性呼吸窘迫综合征肺泡灌洗液细胞凋亡粒细胞集落刺激因子肿瘤坏死因子-α 凋亡诱导配体酶联免疫吸附法健康成年人

Detection of soluble TRAIL in HBV infected patients and its clinical implications

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World Journal of Gastroenterology 2002年第6期8卷 1077-1080页

作者： Li-Hui Han Wen-Sheng Sun Chun-Hong Ma Li-Ning Zhang Su-Xia Liu Qiu Zhang Li-Fen Gao,Institute of Immunology,Medical College of Shandong University,Jinan 250012,Shandong Province,China You-Hai Chen,Institute for Human Gene Therapy,University of Pennsylvania,Philadelphia PA 19104,USA Institute of Immunology Medical College of Shandong University Jinan 250012 Shandong Province China.

AIM: To detect the expression of soluble TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL) in the peripheral blood of HBV infected patients and try to elucidate whether the expression level of sTRAIL have any correlativity with the clinical staging, the expression level of HBV markers and the degree of liver ***: 52 cases of HBV infected patients were investigated, induding 8 HBV carriers, 30 chronic hepatitis B, 11 drrhotics and 3 HBV infection related hepatocellular carcinoma. Expression of soluble TRAIL and markers of the hepatitis B were mearsured by enzyme-linked immunosorbent ***: The expression level of sTRAIL in the peripheral blood of the HBV infected patients was significantly higher than that of healthy controls (1378.35±540.23 pg/ml vs 613.75±175.80 pg/ml, P＜0.001). In the group of chronic hepatitis, the expression level of sTRAIL was coincident with the status of the disease and was significantly correlated with the level of ALT. In the group of cirrhosis and liver cancer, its expression level was significantly higher than that of the healthy persons and HBV carriers, but lower than that of the hepatitis B patients; meanwhile, the expression of siRAIL did not have any correlativity with the functional indexes of the liver. CONCLUSION: The soluble TRAIL in the HBV infected people may participate in the liver damage. Our results indicated that the expression level of soluble TRAIL may reflect the ravage of liver caused by host immune reaction to a certain degree.

关键词： HBV感染患者可溶性TRAIL 凋亡诱导配体检测临床意义乙肝