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人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析

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苏州大学学报（医学版） 2011年第4期31卷 580-585页

作者：王士珍朱旻冯琦陈永珍苏州大学医学部基础医学与生物科学学院人体解剖与组织胚胎学系江苏苏州215123

目的分析人胚胎生殖细胞(hEGC)向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变。方法组织块培养法体外培养hEGC,采用抗坏血酸诱导hEGC向心肌细胞分化,通过免疫荧光法检测诱导后细胞中肌钙蛋白T(cT-nT)的表达;分别提取hEGC及诱导分化2周后的细... 详细信息

目的分析人胚胎生殖细胞(hEGC)向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变。方法组织块培养法体外培养hEGC,采用抗坏血酸诱导hEGC向心肌细胞分化,通过免疫荧光法检测诱导后细胞中肌钙蛋白T(cT-nT)的表达;分别提取hEGC及诱导分化2周后的细胞总蛋白,采用iTRAQ标记、液相色谱(LC)分离总蛋白,串联质谱(MS/MS)鉴定差异蛋白。结果诱导后细胞阳性表达cTnT;通过质谱分析和数据库搜索共鉴定出349种蛋白,其中27种蛋白差异显著。结论 hEGC能诱导分化为心肌细胞;蛋白质组学方法可以高通量筛选hEGC向心肌细胞分化相关的重要蛋白。

关键词：人胚胎生殖细胞肌钙蛋白T 质谱

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人胚胎生殖细胞饲养层的制备

重庆医科大学学报 2011年第12期36卷 1440-1444页

作者：姜蓉黎晓莉吴宏王璐重庆医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室干细胞与组织工程研究室重庆400016

目的:建立稳定高效的人包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblasts,HFF)饲养层培养体系,用于培养人胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells,EGCs)。方法:取4～5岁小儿包皮,采用机械法和组织消化法分离、培养成纤维细胞,倒置相差显微镜观察... 详细信息

目的:建立稳定高效的人包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblasts,HFF)饲养层培养体系,用于培养人胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells,EGCs)。方法:取4～5岁小儿包皮,采用机械法和组织消化法分离、培养成纤维细胞,倒置相差显微镜观察细胞生长状况,免疫细胞化学法、MTT法、流式细胞术检测细胞纯度、生长曲线及细胞周期,筛选丝裂霉素C作用的最佳浓度和时间。分离5～11周人胚胎原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)并培养于经丝裂霉素C处理的HFF饲养层上,观察人EGCs生长情况。结果:机械法和组织消化法结合分离HFF方法可靠,纯度高,细胞生长活性好,能快速进入对数生长期,细胞周期与细胞生长曲线保持一致,细胞可以传60代以上,P3～P30代均适宜作饲养层;丝裂霉素C抑制细胞增殖的适宜浓度及时间为12.5 mg/L作用2.5 h;分离的人PGCs在该饲养层上培养可形成典型的EGCs集落,体外连续培养超过3代。结论:HFF饲养层能有效地支持人EGCs的生长。

关键词：人胚胎生殖细胞包皮成纤维细胞饲养层

人胚胎生殖细胞的原代、传代培养及生物学鉴定

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人胚胎生殖细胞的原代、传代培养及生物学鉴定

作者：陈谦苏州大学

学位级别：硕士

目的:鉴定组织块培养法体外培养人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜所获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞(人EG细胞);尝试不同时间和不同方法对人EG细胞进行传代培养,探讨最佳传代时机和传代方法;并确定传代培养的细胞仍为未分化的人EG细胞。... 详细信息

目的:鉴定组织块培养法体外培养人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜所获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞(人EG细胞);尝试不同时间和不同方法对人EG细胞进行传代培养,探讨最佳传代时机和传代方法;并确定传代培养的细胞仍为未分化的人EG细胞。方法:取5～10周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,用源于自身胚胎组织的成纤维细胞作为饲养层,在不添加任何细胞因子条件下进行组织块培养。以免疫细胞化学法检测培养细胞中SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的表达;利用流式细胞术检测所得细胞中人EG细胞的比例。对原代培养第八天和第16天的细胞采用挑出传代法、消化传代法传代培养,其中消化传代法使用的三种消化液分别是0.25%胰蛋白酶、0.5%胰蛋白酶和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA。检测传代培养后细胞中SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的表达。结果:原代培养的细胞生长良好,免疫细胞化学检测显示,位于饲养层上的细胞及细胞集落阳性表达SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶;流式细胞术检测表明,培养体系中人EG细胞比例约为13%。原代培养至第八天时,细胞生长最旺盛,适合于传代;第16天时,很多人EG细胞集落已分化或消散,丧失了传代的能力。使用胰蛋白酶-EDTA作为消化液消化传代人EG细胞所得的集落最多,效果最佳。通过免疫细胞化学方法检测表明,传代培养第五代细胞仍保持SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的阳性表达。结论:组织块培养法原代培养人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜所获得的细胞为未分化的人EG细胞。最适宜的传代时间是原代培养后第八天,最佳的传代方法是胰蛋白酶-EDTA消化法,且传代培养后的细胞仍为未分化的人EG细胞。

关键词：人胚胎生殖细胞 SSEA-1 SSEA-3 Oct-4 hTERT 传代培养

人胚胎生殖细胞移植治疗猪急性心肌梗死的实验研究

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人胚胎生殖细胞移植治疗猪急性心肌梗死的实验研究

作者：陈晴苏州大学

学位级别：硕士

目的:1.建立猪急性心肌梗死模型;2.观察人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cells,hEGCs)移植到猪急性心肌梗死模型心肌中的存活及分化;3.探讨人EG细胞移植心肌组织后血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表... 详细信息

目的:1.建立猪急性心肌梗死模型;2.观察人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cells,hEGCs)移植到猪急性心肌梗死模型心肌中的存活及分化;3.探讨人EG细胞移植心肌组织后血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及意义。方法:取5-10周流产人胚胎生殖腺嵴,采用组织块培养法培养人EG细胞。单独培养人EG细胞,同时将人EG细胞与胚胎心肌细胞共培养以模拟心肌微环境,分别检测二者第3天与第9天培养上清液中VEGF的表达水平。通过结扎冠状动脉左前降支的方法建立猪急性心肌梗死(AMI)模型,分为移植组、对照组。移植组为将体外扩增的人EG细胞注射到猪梗死心肌周边,对照组用同样方法注射无菌PBS。移植后2周处死猪,用免疫组织化学方法以鼠抗人细胞核抗体MAB1281作示踪剂,检测移植细胞的存活情况,并观察转录因子GATA-4、连接蛋白Cx43在移植细胞的表达。结果:体外培养获得大量人EG细胞,人EG细胞与胚胎心肌细胞共培养组第3天与第9天上清液中VEGF含量分别较人EG细胞单独培养组高,差别有显著意义(P人细胞核抗体MAB1281、转录因子GATA-4、连接蛋白Cx43均呈阳性表达,对照组为阴性表达。结论:在猪急性心肌梗死模型建立后经心外膜移植人EG细胞,人EG细胞在宿主心肌存活且逐渐向心肌细胞分化,植入的人EG细胞可能通过分泌VEGF等细胞因子促进梗死区的心肌修复。

关键词：人胚胎生殖细胞细胞移植 VEGF GATA-4 Cx43

人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及蛋白质组学分析

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人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及蛋白质组学分析

作者：冯琦苏州大学

学位级别：硕士

目的：1.利用抗坏血酸诱导人胚胎生殖细胞（human embryonic germ cells, hEGC,人EG细胞）向心肌细胞分化;2.利用半定量RT-PCR的方法鉴定人EG细胞和诱导后心肌细胞表达GATA-4和ACTC1等基因的情况;3.结合生物信息学的方法推断分化过程中... 详细信息

目的：1.利用抗坏血酸诱导人胚胎生殖细胞（human embryonic germ cells, hEGC,人EG细胞）向心肌细胞分化;2.利用半定量RT-PCR的方法鉴定人EG细胞和诱导后心肌细胞表达GATA-4和ACTC1等基因的情况;3.结合生物信息学的方法推断分化过程中相关蛋白的相互作用关系。方法：取5-10周人胚胎生殖腺嵴，以同源人胚胎成纤维细胞为饲养层，组织块培养法原代培养人EG细胞。将生长良好的人EG细胞，接种于细菌培养皿中进行悬滴、悬浮培养，7天后将形成的拟胚体置于明胶包被的24孔培养板中，加入含0.1mg/ml抗坏血酸的诱导液进行诱导分化培养，免疫荧光法检测诱导2周后细胞心肌连接蛋白Cx43的表达;通过CCK-8法测定诱导后心肌细胞增殖率。设实验组（诱导后的心肌细胞）和对照组（未经诱导的人EG细胞），提取各组细胞的RNA，用紫外分光光度计检测所提RNA的质量与浓度，并进行GATA-4、ACTC1、nkx2.5、KRIT1、Anxa2、VDAC1及CSRP3的RT-PCR反应，取8μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪保存图像。通过“NCBI”等相关网站研究不同组细胞之间差异蛋白的空间结构，及其相互作用关系。结果：组织块培养法培养的人EG细胞增殖旺盛，其集落呈典型的“鸟巢”状。人EG细胞经抗坏血酸诱导2周后，阳性表达Cx43，细胞形态多为梭形，并且分化的细胞不断增殖。半定量RT-PCR结果显示，由人EG细胞分化的心肌细胞表达心肌特异基因GATA-4、ACTC1、Nkx2.5;而各组细胞中均检测到KRIT1、Anxa2等非心肌特异基因的表达，只是表达强度有所不同，且符合质谱分析结果。GATA-4、Nkx2.5与各类心肌肌钙蛋白有着密切的联系。结论：人EG细胞在抗坏血酸的诱导下可分化为心肌细胞。通过筛选经质谱分析得到差异蛋白质中与分化相关的重要蛋白，研究其结构与功能，可为探讨人EG细胞向心肌细胞的定向分化过程及其调控机制奠定基础。

关键词：人胚胎生殖细胞抗坏血酸细胞分化 Cx43 KRIT1 RT-PCR 生物信息学

人胚胎生殖细胞移植治疗猪心肌梗死及心肌再生

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人胚胎生殖细胞移植治疗猪心肌梗死及心肌再生

作者：胡洋苏州大学

学位级别：硕士

目的:1.建立太湖小型猪急性心肌梗死的实验动物模型;2.观察人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cells,hEGCs,人EG细胞)在猪急性心肌梗死模型心脏组织中的存活及分化再生状况;3.探讨人胚胎生殖细胞移植心肌组织后碱性成纤维细胞生长因... 详细信息

目的:1.建立太湖小型猪急性心肌梗死的实验动物模型;2.观察人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cells,hEGCs,人EG细胞)在猪急性心肌梗死模型心脏组织中的存活及分化再生状况;3.探讨人胚胎生殖细胞移植心肌组织后碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达及其意义。方法:取5-10周人胚胎生殖腺嵴,采用组织块培养法体外分离培养人EG细胞。取太湖小型猪2只,在气管插管、呼吸机辅助呼吸、心电监护的基础上,开胸结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending branch,LAD),建立猪急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)模型。建模成功后随机分为移植组和对照组,移植组将体外培养的人EG细胞直接注射到心肌梗死的边缘区,对照组以同样方法注入等量PBS。术后2周处死小型猪,取出心脏组织。以鼠抗人细胞核抗体MAB1281为示踪剂,用免疫组织化学方法检测移植细胞的分布及存活情况,观察心肌形成转录因子NKx2.5和心肌肌钙蛋白T(cTnT)在移植组猪心脏组织的阳性表达;将人EG细胞与人胚胎心肌细胞共培养来模拟心肌微环境,采用ABC-ELISA法检测细胞培养第3天和第9天上清液中bFGF的表达,并与人EG细胞单独培养相比较,探讨人EG细胞移植心肌组织后bFGF的表达及意义。结果:LAD结扎后心电图及心脏组织学观察证实猪AMI模型制作成功;人EG细胞异种异体移植于猪AMI模型,免疫组织化学检测结果显示,移植组心肌梗死区鼠抗人细胞核抗体MAB1281阳性表达,同时可观察到新生的心肌细胞,这些细胞呈NKx2.5和cTnT阳性表达,对照组阴性表达;人EG细胞与心肌细胞共培养上清液中bFGF的表达量比同一时间人EG细胞单独培养均显著增加(P人EG细胞移植此模型心肌组织中不仅能存活,而且呈现向心肌分化的表型;3.人EG细胞与人胚胎心肌细胞共培养上清液中bFGF的表达量比同一时间人EG细胞单独培养均显著增加,提示人EG细胞移植心肌后bFGF的表达显著增加,具有促进缺血心肌血管新生、改善心功能的作用。本实验结果表明:人EG细胞异种异体移植治疗急性心肌梗死是可行的。

关键词：人胚胎生殖细胞细胞移植 NKx2.5 cTnT bFGF

人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析研究

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人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析研究

作者：王士珍苏州大学

学位级别：硕士

目的:1.建立以人胚胎成纤维细胞为饲养层体外培养、扩增人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cells, hEGCs,人EG细胞)的方法。2.利用抗坏血酸诱导人胚胎生殖细胞向心肌细胞分化;3.探讨人胚胎生殖细胞向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱... 详细信息

目的:1.建立以人胚胎成纤维细胞为饲养层体外培养、扩增人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cells, hEGCs,人EG细胞)的方法。2.利用抗坏血酸诱导人胚胎生殖细胞向心肌细胞分化;3.探讨人胚胎生殖细胞向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变。方法:取5-10周人胚胎生殖腺嵴,组织块培养法原代培养人EG细胞;取同一胚胎来源的人胚胎成纤维细胞作饲养层,传代培养人EG细胞。将生长良好的人EG细胞,接种于细菌培养皿中进行悬浮培养,7天后将形成的拟胚体置于明胶包被的24孔培养板中,加入含0.1mg/ml抗坏血酸的诱导液进行诱导分化培养,用免疫荧光法检测诱导2周后细胞中心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达。分别提取人EG细胞和诱导2周后细胞的蛋白质,采用iTRAQ试剂对蛋白样品进行差异标记(114标记诱导细胞蛋白组、115标记人EG细胞蛋白组)、液相色谱(LC)分离这2组样品的总蛋白、串联质谱(MS/MS)鉴定人EG细胞和诱导后细胞差异表达的蛋白。结果:体外培养的人胚胎成纤维细胞呈长梭形,生长状态良好。以同源人胚胎成纤维细胞为饲养层传代培养的人EG细胞增殖旺盛,其集落呈典型的“鸟巢状”,和原代培养形成的克隆大小无明显区别,目前已传到第6代。人EG细胞经抗坏血酸诱导2周后,阳性表达cTnT,细胞呈多边形。质谱分析共鉴定出349种蛋白(蛋白置信度>95%),其中27种蛋白(21种上调蛋白、6种下调蛋白)在人EG细胞和诱导后细胞中差异显著(差异倍数>3)。结论:初步建立了以人胚胎成纤维细胞为饲养层体外扩增人EG细胞的培养方法。人EG细胞在抗坏血酸的诱导下分化为心肌细胞。质谱分析方法可高通量筛选与人EG细胞向心肌细胞分化相关的重要蛋白。

关键词：人胚胎生殖细胞抗坏血酸 cTnT 质谱色谱

SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT在人胚胎生殖细胞中的表达

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2007年第4期28卷 21-24页

作者：李芳陈永珍陈谦朱旻张苏苏州大学医学院江苏苏州215123

分离5~9周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,采用组织块法进行体外培养,免疫细胞化学染色法检测SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT在人胚胎生殖细胞中的表达,以证实利用组织块体外培养所获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞。结果表明:组织块体... 详细信息

分离5~9周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,采用组织块法进行体外培养,免疫细胞化学染色法检测SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT在人胚胎生殖细胞中的表达,以证实利用组织块体外培养所获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞。结果表明:组织块体外培养得到的细胞或细胞集落均阳性表达SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT,说明组织块体外培养获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞。

关键词：人胚胎生殖细胞 SSEA-1 SSEA-3 Oct-4 hTERT 表达

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人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化的研究

苏州大学学报（医学版） 2012年第4期32卷 504-509页

作者：冯琦朱旻陈永珍苏州大学医学部基础医学与生物科学学院人体解剖与组织胚胎学系江苏苏州215123

目的诱导人胚胎生殖细胞(hEGC)向心肌细胞分化,初步探讨其定向分化过程及调控机制。方法组织块培养法体外培养hEGC,采用抗坏血酸诱导hEGC向心肌细胞分化,通过CCK-8法测定诱导后心肌细胞增殖率,免疫荧光法检测心肌连接蛋白Cx43的表达;利... 详细信息

目的诱导人胚胎生殖细胞(hEGC)向心肌细胞分化,初步探讨其定向分化过程及调控机制。方法组织块培养法体外培养hEGC,采用抗坏血酸诱导hEGC向心肌细胞分化,通过CCK-8法测定诱导后心肌细胞增殖率,免疫荧光法检测心肌连接蛋白Cx43的表达;利用半定量RT-PCR的方法鉴定hEGC和诱导后心肌细胞GATA-4和ACTC1等基因的表达;结合生物信息学方法推断分化过程中各蛋白的相互作用关系。结果诱导后细胞阳性表达Cx43,且表现出一定的增殖能力;其表达GATA-4、ACTC1等基因的强度与未经诱导的hEGC均有所不同;GATA-4、Nkx2.5与各类心肌肌钙蛋白有着密切的联系。结论 hEGC能诱导分化为心肌细胞;蛋白质组学方法可以协助探讨其分化过程及调控机制。

关键词：人胚胎生殖细胞细胞分化生物信息学 RT-PCR