人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及蛋白质组学分析

作     者：冯琦 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈永珍

授予年度：2012年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：人胚胎生殖细胞 抗坏血酸 细胞分化 Cx43 KRIT1 RT-PCR 生物信息学 

摘      要：目的：1.利用抗坏血酸诱导人胚胎生殖细胞（human embryonic germ cells, hEGC,人EG细胞）向心肌细胞分化;2.利用半定量RT-PCR的方法鉴定人EG细胞和诱导后心肌细胞表达GATA-4和ACTC1等基因的情况;3.结合生物信息学的方法推断分化过程中相关蛋白的相互作用关系。 方法：取5-10周人胚胎生殖腺嵴，以同源人胚胎成纤维细胞为饲养层，组织块培养法原代培养人EG细胞。将生长良好的人EG细胞，接种于细菌培养皿中进行悬滴、悬浮培养，7天后将形成的拟胚体置于明胶包被的24孔培养板中，加入含0.1mg/ml抗坏血酸的诱导液进行诱导分化培养，免疫荧光法检测诱导2周后细胞心肌连接蛋白Cx43的表达;通过CCK-8法测定诱导后心肌细胞增殖率。设实验组（诱导后的心肌细胞）和对照组（未经诱导的人EG细胞），提取各组细胞的RNA，用紫外分光光度计检测所提RNA的质量与浓度，并进行GATA-4、ACTC1、nkx2.5、KRIT1、Anxa2、VDAC1及CSRP3的RT-PCR反应，取8μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪保存图像。通过“NCBI等相关网站研究不同组细胞之间差异蛋白的空间结构，及其相互作用关系。 结果：组织块培养法培养的人EG细胞增殖旺盛，其集落呈典型的“鸟巢状。人EG细胞经抗坏血酸诱导2周后，阳性表达Cx43，细胞形态多为梭形，并且分化的细胞不断增殖。半定量RT-PCR结果显示，由人EG细胞分化的心肌细胞表达心肌特异基因GATA-4、ACTC1、Nkx2.5;而各组细胞中均检测到KRIT1、Anxa2等非心肌特异基因的表达，只是表达强度有所不同，且符合质谱分析结果。GATA-4、Nkx2.5与各类心肌肌钙蛋白有着密切的联系。 结论：人EG细胞在抗坏血酸的诱导下可分化为心肌细胞。通过筛选经质谱分析得到差异蛋白质中与分化相关的重要蛋白，研究其结构与功能，可为探讨人EG细胞向心肌细胞的定向分化过程及其调控机制奠定基础。