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蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的规模化富集鉴定方法研究

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蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的规模化富集鉴定方法研究

作者：时照梅安徽医科大学

学位级别：硕士

0-GlcNAc糖基化修饰是普遍存在于细胞核蛋白和质蛋白中的一种翻译后修饰,它通常是由单糖以0-糖苷键的形式与蛋白质上的丝氨酸或苏氨酸的羟基相连,是一种重要的胞内修饰调控方式。它参与整个细胞进程和多种应激反应,如细胞周期调控、基... 详细信息

0-GlcNAc糖基化修饰是普遍存在于细胞核蛋白和质蛋白中的一种翻译后修饰,它通常是由单糖以0-糖苷键的形式与蛋白质上的丝氨酸或苏氨酸的羟基相连,是一种重要的胞内修饰调控方式。它参与整个细胞进程和多种应激反应,如细胞周期调控、基因调控、信号传导、转录、翻译等;多种疾病的发生发展都与0-GlcNAc糖基化的异常密切相关,如癌症、阿尔兹海默病、帕金森病、糖尿病等。由于0-GlcNAc修饰高度动态变化,且含量低、质谱响应差,导致鉴定极为困难,所以对0-GlcNAc修饰蛋白或肽段进行高效富集是实现修饰位点规模化鉴定的前提条件。本文创新性的采用氧化石墨烯固定化凝集素(GO-WGA)与亲水相互作用色谱法(HILIC)开展了0-GlcNAc糖蛋白／糖肽的富集新方法研究。建立了基于GO-WGA对0-GlcNAc糖蛋白的富集新方法和基于对多组分嵌段亲水聚合物修饰的HILIC填料的0-GlcNAc糖肽亲和富集和规模化质谱鉴定新方法,并将后者成功应用于HeLa细胞核、质蛋白,RNA/DNA结合蛋白和组蛋白的0-GlcNAc修饰位点鉴定,以及磷酸化和0-GlcNAc糖基化竞争修饰的“串话”研究。本文第一章对目前常用的0-GlcNAc修饰蛋白／肽段的富集方法进行总结,并对亲水相互作用色谱法(HILIC)在糖肽规模化富集鉴定中的应用现状进行分析;第二章建立了基于GO-WGA对0-GlcNAc糖蛋白的富集新方法和一种基于多组分嵌段亲水聚合物修饰的HILIC填料的0-GlcNAc修饰肽段富集新方法;第三章将糖肽富集方法应用于RNA结合蛋白、DNA结合蛋白、组蛋白的0-GlcNAc糖肽的富集和修饰位点鉴定;第四章则开展了0-GlcNAc糖基化与磷酸化竞争修饰的“串话”研究。在第二章中,我们利用GO-WGA成功富集标准0-GlcNAc糖蛋白：牛晶体蛋白(a-Crystallin),利用多组分嵌段亲水聚合物修饰的HILIC填料建立了0-GlcNAc修饰糖肽的富集新方法,成功在HeLa细胞系中鉴定到1145个0-GlcNAc蛋白,1770个0-GlcNAc肽段,2612个0-GlcNAc修饰位点,将现有鉴定规模提高1倍以上;在第三章中,我们有效提取了RNA结合蛋白、DNA结合蛋白以及组蛋白,并将HILIC富集0-GlcNAc修饰糖肽的新方法应用于这三类蛋白,成功建立了针对低丰度功能蛋白质群的0-GlcNAc修饰的串联富集方法,鉴定到55和RNA结合蛋白含有0-GlcNAc修饰,26个DNA结合蛋白中含有0-GlcNAc修饰,并在组蛋白中也鉴定到了多个新的0-GlcNAc修饰位点;在第四章中,我们发现经HILIC富集的0-GlcNAc糖肽样品,对其质谱采集结果在搜库检索时如果增加磷酸化的可变修饰,可以明显增加0-GlcNAc的位点鉴定数量,并且磷酸化和0-GlcNAc糖基化修饰通常发生在同一条肽段的相邻位置,为两种竞争修饰的“串话”研究提供了新的途径。本研究建立了基于多组分嵌段亲水聚合物修饰的HILIC填料的0-GlcNAc修饰糖肽富集新方法,构建了目前最大规模的0-GlcNAc修饰蛋白及位点数据集,并将此方法成功应用于低丰度功能蛋白群的0-GlcNAc位点鉴定,以及磷酸化、0-GlcNAc糖基化竞争修饰的“串话”研究。为糖蛋白质组学和蛋白质功能研究提供有力的技术支持。

关键词： O-GlcNAc糖基化 HILIC填料亲和富集磷酸化蛋白质组学

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细胞培养稳定核素标记技术的发展与应用

第二军医大学学报 2014年第8期35卷 892-897页

作者：吕权真阎澜姜远英第二军医大学药学院新药研究中心上海200433

细胞培养稳定核素标记(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)技术是一种利用稳定核素标记细胞内蛋白并根据质谱丰度比率进行定量的体内代谢标记技术。结合不同的蛋白亲和富集方式,可以获得较高灵敏度和准确... 详细信息

细胞培养稳定核素标记(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)技术是一种利用稳定核素标记细胞内蛋白并根据质谱丰度比率进行定量的体内代谢标记技术。结合不同的蛋白亲和富集方式,可以获得较高灵敏度和准确性的蛋白定量信息。本文综述了SILAC技术的发展历史、原理、特点以及应用,着重介绍了其在研究蛋白质与小分子间的相互作用、定量蛋白组学以及蛋白翻译后修饰等方面的应用进展。

关键词：细胞培养稳定核素标记亲和富集质谱定量蛋白组学

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糖基化蛋白质组学:结构、功能和研究方法

生命科学 2018年第4期30卷 480-490页

作者：张勇沈丙权秦伟捷钱小红应万涛军事科学院军事医学研究院生命组学研究所蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心国家蛋白质科学中心-北京北京102206

蛋白质糖基化修饰结构多样、分布广泛,以N-糖基化、O-Gal NAc糖基化和O-Glc NAc糖基化等不同修饰形式存在。糖修饰以各种方式广泛参与基本生物学过程,包括基因转录、蛋白质翻译、信号转导、细胞-细胞间以及宿主-病原体相互作用等。糖基... 详细信息

蛋白质糖基化修饰结构多样、分布广泛,以N-糖基化、O-Gal NAc糖基化和O-Glc NAc糖基化等不同修饰形式存在。糖修饰以各种方式广泛参与基本生物学过程,包括基因转录、蛋白质翻译、信号转导、细胞-细胞间以及宿主-病原体相互作用等。糖基化修饰的异常变化与多种重要疾病的发生发展相关,包括免疫性疾病、肿瘤、先天性糖缺陷等。该文系统展示几种常见糖修饰的结构、参与的生理病理过程,以及最新的研究方法,尤其是糖修饰蛋白质或肽段的特异性富集方法和基于质谱的序列分析方法进展,以期丰富糖修饰蛋白质的研究手段,为糖蛋白质功能机制研究、疾病治疗靶标或候选标志物的发现提供新视角。

关键词：糖基化修饰亲和富集质谱肿瘤

基于SH2超亲体的富集方法用于酪氨酸磷酸化的高灵敏分析

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基于SH2超亲体的富集方法用于酪氨酸磷酸化的高灵敏分析

中国化学会第22届全国色谱学术报告会及仪器展览会

作者：姚亚婷王龑刘晓艳叶明亮中国科学院大连化学物理研究所中国科学院大学

＜正＞蛋白质磷酸化作为真核细胞信号转导中的核心,在生命系统中发挥着重要作用。其中酪氨酸残基的磷酸化作为较高级的进化形式和复杂的多细胞生命的特征表现得尤为突出和重要,是在生物体内调节生物学进程和细胞活动的一个闸门。酪氨酸... 详细信息

＜正＞蛋白质磷酸化作为真核细胞信号转导中的核心,在生命系统中发挥着重要作用。其中酪氨酸残基的磷酸化作为较高级的进化形式和复杂的多细胞生命的特征表现得尤为突出和重要,是在生物体内调节生物学进程和细胞活动的一个闸门。酪氨酸磷酸化及其激酶参与调控多个重要的生物过程,包括细胞增殖、细胞周期进程、细胞凋亡、血管生成、细胞迁移、

关键词：酪氨酸磷酸化 SH2超亲体亲和富集

来源： cnki会议评论

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自身免疫抗体噬菌体库的构建及初步鉴定

自身免疫抗体噬菌体库的构建及初步鉴定

作者：吴炜霖第二军医大学

学位级别：硕士

研究目的: 自身免疫性疾病(autoimmune diseases, AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损伤所引起的疾病,是一类较常见的难治病。其突出特点是患者体内产生高滴度自身抗体,并通过免疫复合物等途径,产生针对自身组织的免... 详细信息

研究目的: 自身免疫性疾病(autoimmune diseases, AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损伤所引起的疾病,是一类较常见的难治病。其突出特点是患者体内产生高滴度自身抗体,并通过免疫复合物等途径,产生针对自身组织的免疫病理性损伤,累及一个或全身多个器官、系统。自身免疫病发病机制十分复杂,涉及因素众多。一般认为以免疫活性细胞数量和功能的失常,导致免疫功能紊乱,从而产生大量自身抗体为主要机制,但具体机制并不明确。因而自身抗体的研究往往成为对自身免疫性疾病研究的关键点和切入点。目前,自身免疫病的诊断手段非常有限,主要是在结合临床的基础上,依赖实验室检查,在AID患者体内检测到一种或多种高效价的自身抗体为诊断该病的重要依据。自身免疫病缺乏特异的早期诊断指标及特效的治疗药物,这都直接影响了疾病的诊断和治疗。因此,获得纯化的可以满足不同需要的高亲和力、高特异性自身抗体对于研究自身免疫性疾病的发病机制及临床诊疗都具有非常重要的价值。抗体的制备工艺历经100多年的发展,经历了从多克隆抗体、单克隆抗体到人源化抗体的不同阶段。在人源单克隆抗体的制备技术中,噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体制备技术之一。利用此技术,外源蛋白或多肽的基因与噬菌体外壳蛋白的基因融合,外源产物表达在噬菌体的表面,从而实现了基因型与表现型的完美统一。目前,国内外已成功构建了针对乙肝病毒、肿瘤细胞等多种抗原的噬菌体抗体库,并从中筛选得到具有较高亲和力和特异性的抗体,潜藏着巨大的应用价值。本课题采用噬菌体抗体库技术,以50多例自身免疫病患者的外周血淋巴细胞为原料,构建出自身免疫性疾病的噬菌体抗体库,并以确定的自身抗原dsDNA作为固相抗原,从抗体库中筛选、富集出相关抗体,以鉴定所构建抗体库的有效性,为进一步利用该抗体库筛选出不同需要的抗体及其功能研究提供平台。研究方法: 1.从55名自身免疫性疾病患者(包括SLE、RA、强直性脊柱炎、干燥综合征、PBC等)外周血中分离出单个核细胞,抽提总RNA,反转录生成cDNA,以内参GADPH验证混合cDNA的质量;2.以上述cDNA为模板PCR扩增轻链和重链基因;3.挑取XL1-Blue的单克隆菌落,采用Hepes法制备感受态细胞;4.将轻链基因克隆入pComb3Hss载体以构建轻链库;5.将重链基因载入重组轻链库,构建组合文库H+L+pComb3Hss;6.将组合文库转化大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体M13KO7,随机的组合文库表达于噬菌体表面,完成噬菌体表面展示;7.用商品化anti-dsDNA ELISA试剂盒,对噬菌体抗体进行4轮亲和富集,测定抗体库滴度;8.间接ELISA法鉴定4轮淘选后的噬菌体抗体,提取阳性克隆的的噬菌粒,切除gIII片段,自连接后转化XL1-Blue,以IPTG诱导可溶性Fab片段的表达;9.分别用anti-dsDNA和anti-U1RNP检测试剂盒对制备好的Fab片段进行ELISA检测,鉴定其抗原特异性。结果: 1.抽取总RNA 7-10ug,抽提的RNA质量可靠,经GADPH验证的cDNA质量可靠;2. PCR扩增了大小为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了重组轻链库,菌落计数得轻链库的库容约4×105,酶切鉴定重组率为80%;3.同法测得噬菌体抗体库的库容为6×106,酶切鉴定重组率为70%,PCR鉴定证明轻重链均已转入,噬菌体抗体库构建成功;4.用抗原固相法对噬菌体抗体库进行了4轮亲和富集,第1轮洗脱的滴度为1.1×105,第2、3轮都较前有较大提高,第4轮产出率比第1轮加了218倍;5.通过固相化抗原吸附法筛选获得2个阳性克隆,切除gIII基因,实现了可溶性Fab片段的表达;6.间接ELISA法检测显示6株Fab片段克隆均呈dsDNA阳性,U1RNP阴性,证实获得的可溶性抗体Fab片段具有特异性抗原结合活性。结论: 利用自身免疫性疾病患者的外周血单个核细胞制备了混合cDNA,并在此基础上成功构建了自身免疫性疾病的噬菌体抗体库,经亲和富集后实现了抗体Fab段的可溶性表达,并具有较强的抗原特异性,因此该抗体库的建立为进一步筛选出其他高亲和力的自身抗体及其功能研究打下了基础,提供了良好的库源。

关键词：自身免疫性疾病噬菌体抗体库构建鉴定亲和富集 ELISA

基于DNA模板光交联生物质谱鉴定结合蛋白的研究

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基于DNA模板光交联生物质谱鉴定结合蛋白的研究

作者：毕文静天津医科大学

学位级别：硕士

DNA或RNA适配体具有选择性识别病变细胞的能力,在生物标志物的发现和疾病早期诊断方面显示了应用潜力。目前的研究表明:适配体是通过与细胞表面特异性蛋白的结合来实现对细胞的分辨。然而由于适配体与细胞表面靶标蛋白之间的作用力往往... 详细信息

DNA或RNA适配体具有选择性识别病变细胞的能力,在生物标志物的发现和疾病早期诊断方面显示了应用潜力。目前的研究表明:适配体是通过与细胞表面特异性蛋白的结合来实现对细胞的分辨。然而由于适配体与细胞表面靶标蛋白之间的作用力往往很弱,因此精准鉴定适配体的结合蛋白仍然非常困难,已成为瓶颈问题之一,迫切需要发展高灵敏的分析方法。组蛋白翻译后修饰(Histone Post-translational modifications,HPTMs)可以通过招募结合蛋白及复合物调控基因转录。最近研究发现:临近的组蛋白修饰具有协调或拮抗的作用,改变与结合蛋白的作用,从而影响转录。然而多种修饰介导的蛋白作用的表征和检测非常困难,国际上一直缺乏有效的分析手段。针对以上问题,我们提出“发展鉴定结合蛋白的高灵敏分析方法”。本文分别以适配体、修饰多肽为诱饵,构建了基于DNA模板和光交联技术的分子探针,联合生物质谱技术,分别建立了适配体识别蛋白和组蛋白多修饰结合蛋白的高灵敏分析方法。研究内容主要分为以下两个部分:第一部分:基于DNA模板化学和光交联技术,利用核酸适配体的识别特性,以溶菌酶为模型,设计了一种核酸适配体分子探针,用于研究目标蛋白溶菌酶的选择性标记和富集。一方面,探针可将较弱的“核酸-蛋白”分子间作用转化为共价键合,提高了适配体结合蛋白的捕获;另一方面,将交联剂固载在另一条独立的单链DNA上,从而降低了以往交联剂对适配体与结合蛋白专一性识别的干扰。在优化的条件下,探针对溶菌酶显示出高灵敏性和高选择性的标记和富集,实现了复杂背景下以及实际样品中对目标蛋白的标记和富集,并通过质谱进行了鉴定。实验结果显示这一新方法在发现适配体结合蛋白方面具有潜力。第二部分:基于多肽修饰识别、DNA自组装和亲和光交联技术,我们设计了多肽探针,探索多种修饰介导的结合蛋白分析新方法,并以此研究了组蛋白H3T3(苏氨酸)磷酸化/H3K4(赖氨酸)三甲基与蛋白结构域PHD的互作。实验结果表明:H3T3磷酸化抑制了H3K4三甲基化对PHD的识别,从分析化学层面验证了文献报道的发现。我们的研究显示:建立的方法可用于分析多种修饰介导下的结合蛋白,以及修饰间相互作用,在生物医学中具有潜在应用价值。

关键词：液相色谱-质谱适配体组蛋白修饰 DNA 化学模板亲和富集

基于自组装光交联多肽探针和生物质谱鉴定组蛋白修饰结合蛋白的研究

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基于自组装光交联多肽探针和生物质谱鉴定组蛋白修饰结合蛋白的研...

作者：陈聪天津医科大学

学位级别：硕士

组蛋白翻译后修饰是表观遗传学的重要组成部分,参与调控基因转录,决定细胞命运,其异常表达往往与人类许多重大疾病的发生、发展密切相关。目前普遍认为,组蛋白修饰发挥功能的重要途径之一是通过招募特异性结合蛋白,进而调控下游的生物... 详细信息

组蛋白翻译后修饰是表观遗传学的重要组成部分,参与调控基因转录,决定细胞命运,其异常表达往往与人类许多重大疾病的发生、发展密切相关。目前普遍认为,组蛋白修饰发挥功能的重要途径之一是通过招募特异性结合蛋白,进而调控下游的生物学活动,因此组蛋白修饰结合蛋白的鉴定对了解其表观遗传调控有着重要的生物学意义。然而,由于组蛋白修饰是动态变化的、修饰结合蛋白的丰度通常很低、修饰与其结合蛋白间的相互作用力弱且通常是瞬时的,因此人们对组蛋白修饰结合蛋白的了解远远滞后于修饰的研究,这在一定程度上阻碍了人们对修饰,尤其是新修饰的深入认识。本文构建了一种自组装光亲和多肽探针,该探针通过自组装技术同时将多肽和光交联基团连接到纳米金上,以多肽为诱饵,通过光交联反应将弱的非共价作用转化为稳定的共价键,提高结合蛋白的捕获。同时,光交联基团二苯甲酮和纳米金之间以聚乙二醇连接,通过对聚乙二醇长度和量的优化使光交联基团处于更优的空间位置,可以达到更优的光交联效果。在此基础上,我们将探针富集与蛋白质组学方法相结合,用带有修饰的多肽饰探针和不带修饰的多肽探针(对照)分别从核蛋白中富集结合蛋白,通过定量蛋白质组学技术将修饰的特异性结合蛋白从背景蛋白中分辨出来。我们将该方法首先运用到已知结合蛋白相对较多H3K4me3上,富集到了一些H3K4me3已知的直接和间接结合蛋白,验证了该方法的可行性。组蛋白赖氨酸β-羟基丁酰化(β-hydroxybutyrylation,bhb)、2-羟基异丁酰化(2-hydroxyisobutyrylation,hib)以及巴豆酰化(crotonylation,cr)都是近几年发现的新的赖氨酸修饰形式,其中赖氨酸β-羟基丁酰化发现最晚,该修饰不改变赖氨酸的电性,所以它很可能主要通过招募结合蛋白发挥功能,且其结合蛋白目前未见报道。因此我们将上述发展的方法应用到了H3K9bhb上,通过探针富集和质谱定量,结合相关生物学功能,发现了H3K9bhb的潜在结合蛋白ENL,通过PRM和western blot验证了定量结果的准确性,并通过计算机模拟分子对接实验解释了ENL识别K9bhb的结构基础。我们也将该方法应用到了H3K9hib及H3K9cr上,富集到了已知的结合蛋白的以及未报道的潜在结合蛋白,并借助生物信息学工具对这些结合蛋白进行了分子功能、细胞组分、生物过程的分析。由于这三种修饰在结构上具有一定的相似性,我们对这三种探针富集到结合蛋白的异同进行了比较。实验结果表明,我们的自组装光亲和多肽探针富集,结合基于质谱的定量蛋白质组学方法在研究组蛋白修饰与其结合蛋白的相互作用方面有着重要的应用潜力。

关键词：组蛋白翻译后修饰结合蛋白蛋白质组学光交联亲和富集

基于RNA广谱亲和试剂的蛋白质组深度覆盖新策略研究

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基于RNA广谱亲和试剂的蛋白质组深度覆盖新策略研究

作者：任晓君北京工业大学

学位级别：硕士

随着人类全基因组测序的完成，生命科学的研究进入了后基因组时代。蛋白质组学研究作为后基因组时代的主力军得到了飞速发展。大规模地对蛋白质的种类、功能、相互作用及动态变化等方面的研究，可从更高层次阐述生物体生命活动的规律和... 详细信息

随着人类全基因组测序的完成，生命科学的研究进入了后基因组时代。蛋白质组学研究作为后基因组时代的主力军得到了飞速发展。大规模地对蛋白质的种类、功能、相互作用及动态变化等方面的研究，可从更高层次阐述生物体生命活动的规律和揭示病理变化过程的本质。生物质谱的广泛应用极大地推动了蛋白质大规模鉴定的发展。然而，由于蛋白质样品高度的复杂性、极宽的丰度范围及质谱检测灵敏度和扫描速度的局限性，极大的限制了在细胞生理功能调控和临床诊断中发挥关键作用的低丰度蛋白的鉴定。因此，新型的低丰度蛋白富集技术的发展成为当前蛋白质组学的研究热点。本文针对目前在低丰度蛋白质规模化富集、鉴定方面的技术瓶颈，利用RNA可以与蛋白质发生生理或非生理性特异性结合的特点，发展了基于RNA的低丰度蛋白质广谱亲和试剂，实现了低丰度蛋白规模化地富集与鉴定，为哺乳动物蛋白质组的深度覆盖研究提供了新的策略和技术支撑。研究第一部分发展了基于内源性mRNA文库的低丰度蛋白质广谱亲和试剂，成功实现了小鼠肝脏低丰度蛋白质的规模化富集与鉴定。分析结果显示，通过mRNA文库富集结合高pH反相色谱分离技术，可以鉴定4000多种蛋白质。与paxdb蛋白质丰度数据库相比，首次鉴定到1352个小鼠肝脏蛋白质。mRNA文库富集后低丰度蛋白质的鉴定比例明显高于未经富集的鉴定结果，特别是在富集结果中包括已知的RNA结合蛋白429个，覆盖了已知小鼠RNA结合蛋白的53.4%，超过目前相关文献对RNA结合蛋白的鉴定覆盖率。另外对富集鉴定的蛋白质进行了功能、结构和定位等生物信息学分析，为RNA结合蛋白的研究提供了新的信息。在成功建立基于內源性mRNA文库的富集策略的基础上，研究第二部分发展了基于外源性RNA适配体的低丰度目标蛋白富集技术，实现了目标蛋白质的有效富集，初步构建了低丰度蛋白质及其对应RNA适配体的数据库。在优化富集技术路线的基础上，设计了13条适配体序列并应用于小鼠肝脏蛋白质的富集。综合富集结果，共鉴定到595个低丰度蛋白质，并提供了它们所结合的RNA适配体序列信息。本研究发展的基于内源性mRNA文库和外源性RNA适配体富集策略的使用，可以大大提高目前蛋白质组鉴定的覆盖水平，为人类蛋白质组计划的实施提供了新的技术策略和技术保障。

关键词：蛋白质组学低丰度 RNA结合蛋白亲和富集

基于色谱-质谱联用技术的动态蛋白质复合物分析及生物医学应用

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基于色谱-质谱联用技术的动态蛋白质复合物分析及生物医学应用