基于纳米材料的磷酸肽选择性富集及质谱鉴定新方法研究

作     者：王鑫慧 

作者单位：南京师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周家宏;陶义华

授予年度：2021年

学科分类：081703[工学-生物化工] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 0836[工学-生物工程] 

主      题：磷酸化蛋白质组学 质谱分析 磷酸化肽 多磷酸化肽 亲和富集 

摘      要：蛋白质磷酸化修饰是生物体内最重要的翻译后修饰之一,调节着生命活动中许多重要过程,包括细胞增殖、分化、新陈代谢及肿瘤的发生。然而,由于磷酸化蛋白含量低,离子化效率差等原因,直接用质谱进行磷酸化蛋白质组学研究仍然面临着诸多困难。因此,为了完成磷酸化蛋白质组学研究,在质谱分析之前对磷酸化肽段进行选择性富集成为一个必要的前处理手段。针对上述问题,本论文开展如下研究:1.在诸多的富集方法和策略中,基于Ti的固定金属亲和层析(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)材料因其较高的选择性、较好的重复利用率等优点在磷蛋白组质谱分析中表现出了较高的潜力。然而,传统Ti-IMAC材料水溶性较差且比表面积小的缺点极大地限制了其对亲水性磷酸肽的富集效率。为了基于一种材料克服以上缺陷,我们成功设计合成了一种以环糊精改性的碳纳米管为载体的Ti-IMAC材料(COOH-CNTs-CD-Ti)。其中,碳纳米管拥有较大的比表面积,为磷酸肽的吸附提供了更大的附着位点,而环糊精则拥有较好的亲水性,这使得Ti-IMAC材料对磷酸肽的键合更加有效。研究结果显示,COOH-CNTs-CD-Ti纳米材料对磷酸肽具有强的选择富集能力,即使磷酸肽浓度低至1×10M时仍表现出较高的灵敏性,这表明环糊精和碳纳米管的使用极大地改善了Ti-IMAC材料在磷酸肽富集过程中的缺陷,同时也为磷酸化蛋白质组学前处理提供了一种强有力的工具。2.我们进一步对生物学功能更加重要的多磷酸肽富集进行深入研究。目前多磷酸肽特异性富集研究仍处于起步阶段,所用富集材料种类有限且合成方法复杂,这既不利于多磷酸肽富集机理的阐明也不利于实际应用的推广。因而,本课题在Ti-IMAC材料的理论基础之上,结合多磷酸肽区别于单磷酸肽和非磷酸肽的独特性质,选取合成简单、性能稳定的纳米磷酸钙对多磷酸肽进行富集研究。研究结果表明,纳米磷酸钙能够有效地从磷酸肽(单磷酸肽和多磷酸肽)和非磷酸肽混合物中选择性富集多磷酸肽并具有良好的稳定性,选择特异性及重复性。同时,对存在100倍(摩尔比)牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)干扰的1 x10 M的β-酪蛋白酶切肽段样品中的多磷酸肽也完成了富集鉴定。纳米磷酸钙优良的富集性能为其在多磷酸化蛋白位点鉴定应用中提供了可能。本文从磷酸化蛋白质组学的实际应用出发,先是改善了传统IMAC材料在磷酸肽富集中的缺陷,并对影响磷酸肽富集的关键因素,如材料的亲水性以及比表面积等因素进行了详尽的讨论。随着研究的深入,本课题进一步凝练,对更加重要的多磷酸肽进行富集研究,并系统研究了多磷酸肽富集材料的性质,进而对多磷酸肽富集机理及规律进行了初步阐明。总的来说,本文不仅是对磷酸肽选择性富集方法理论的一种完善,同时也为多磷酸化位点鉴定提供了一种有效方法,为磷酸化蛋白质组学走向实际应用奠定了一定基础。