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环糊精糖基转移酶分子改造、产物特异性及其酶学性质研究

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环糊精糖基转移酶分子改造、产物特异性及其酶学性质研究

作者：凌凯合肥工业大学

学位级别：硕士

环糊精糖基转移酶(CGTase)是一种多功能酶,可以催化多聚糖分子内的转糖基作用,即环化反应,也能参与偶合反应、水解反应、歧化反应等分子间的转糖基作用。通过环化反应催化淀粉及相关基质生成环糊精是其产业应用的基础,最常见的是生产α... 详细信息

环糊精糖基转移酶(CGTase)是一种多功能酶,可以催化多聚糖分子内的转糖基作用,即环化反应,也能参与偶合反应、水解反应、歧化反应等分子间的转糖基作用。通过环化反应催化淀粉及相关基质生成环糊精是其产业应用的基础,最常见的是生产α-、β-、γ-环糊精。环糊精具有外部亲水内腔疏水的特点,能够包含客体分子从而改变其物理化学性质,如增加溶解性和稳定性,在食品、化妆品、医药、环境保护等方面具有重要作用。而作为生产环糊精的关键酶,CGTase越来越引起人们的重视。目前已有的CGTase催化产物都是α-、β-、γ-环糊精的混合物,较差的产物特异性对单一环糊精的产率及后续纯化分离造成不利影响。因此,借助基因工程手段对CGTase进行定点突变改善CGTase的产物特异性成为重要研究方向之一。针对上述问题,本文以前期构建的含有重组质粒pET22b/cgt为基础,对CGTase关键氨基酸序列进行饱和突变,分析氨基酸与CGTase产物特异性之间的内在联系,主要结果如下：通过多重序列对比及相关文献分析,发现来源于蜡状芽孢杆菌的CGTase 43位氨基酸对CGTase产物特异性具有重要作用。实验中以构建的重组质粒pET22b/cgt为模板,采用全质粒的突变方法对43位组氨酸进行饱和突变,将酶解过后的PCR产物转进大肠杆菌DMT中,在含有100μg/mL的LB平板筛选得到阳性克隆菌株,成功构建突变株H43P、H43Q、H43L、H43I、H43F、H43K、H43A、H43C、H43Y、 H43E、H43N、H43R、H43S、H43T、H43G、H43M、H43W;以1CXK作为模板,采用同源建模的方式构建了来源于Bacillus cereus的CGTase的空间结构,并用分子动力学软件对模建的结构进行优化获得了可靠的蛋白质三维模型。通过与麦芽九糖抑制剂的分子对接,分析了底物结合凹槽处的相关情况,对-3亚位点及43位氨基酸做出分析;通过定点突变技术将43位的组氨酸突变成苯丙氨酸(H43F)、酪氨酸(H43Y)和色氨酸(H43W)后,CGTase酶活力从6570 U/mL提高到6667U/mL、7814U/mL、15609U/mL,说明含有芳香环的氨基酸有利于提升CGTase降解玉米淀粉的能力：大部分氨基酸代替CGTase 43位的组氨酸后,β-CD在产物中所占比例减小,而γ-CD比例增加。用残基侧链短的氨基酸代替原有位置的组氨酸,如H43P、H43A、H43G突变酶的催化产物中γ-CD所占比率为30.2%、28.3%、28.1%,其中原始酶组γ-CD占20%;用疏水性强的亮氨酸和异亮氨酸代替组氨酸后,H43I、H43L突变酶催化产物中γ-CD所占比率为28.4%和28.0%;另外H43T突变酶催化产物中γ-CD所占比率为29.2%;对γ-CD特异性最好的H43P、H43I、H43T突变酶进行酶学性质分析,发现与原始酶性质相似,突变酶的最适温度为60℃,最适pH为9.0,pH在6.0到9.0区间内保持稳定,但是H43P、H43I突变酶的热稳定性比原始酶更好,80℃时仍然有60%、62%的残存活力;酶的动力学性质方面,H43P突变酶的Km值变小,H43I和H43T突变酶的Km变大,说明H43P突变酶与可溶性淀粉的亲和力变强,使得H43P作用于玉米淀粉生成y-CD的催化效率比原始酶高14.8%。

关键词：环糊精糖基转移酶定点突变产物特异性酶学性质

钙离子结合位点处氨基酸残基突变改善环糊精葡萄糖基转移酶产物特异性的研究

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钙离子结合位点处氨基酸残基突变改善环糊精葡萄糖基转移酶产物特...

作者：班宵逢江南大学

学位级别：硕士

环糊精具有独特的中空立体结构，可以包合多种客体分子，广泛应用于食品、医药等领域。环糊精葡萄糖基转移酶（以下简称CGT酶）可以利用淀粉及其相关基质通过分子内转糖基反应合成环糊精，通常用于环糊精的工业化生产。CGT酶产物特异性... 详细信息

环糊精具有独特的中空立体结构，可以包合多种客体分子，广泛应用于食品、医药等领域。环糊精葡萄糖基转移酶（以下简称CGT酶）可以利用淀粉及其相关基质通过分子内转糖基反应合成环糊精，通常用于环糊精的工业化生产。CGT酶产物特异性较差是工业上生产环糊精不利的因素之一，已知野生CGT酶生产的都是α-、β-和γ-环糊精的混合物，不利于产物的分离和纯化，且大幅增加了环糊精的生产成本。因此，着力于提高CGT酶的产物特异性以适应环糊精工业化生产的需要显得尤为重要。本论文通过定点突变技术改善来源于环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）STB01CGT酶的产物特异性，实现了CGT酶β-环糊精特异性的提高。首先，通过多重序列比对和晶体模拟分析，发现钙离子结合位点普遍存在于α-淀粉酶家族中，其钙离子结合位点处多为侧链短小且亲水性较强的氨基酸残基，并探索了CGT酶钙离子结合位点（CaI，CaII和CaIII）的结构与功能。分析研究表明，钙离子结合位点CaII在不同来源的α-淀粉酶和CGT酶中保守性较高，多位于酶活性中心，其突变往往对酶活力产生剧烈影响;而CaI和CaIII在不同来源的CGT酶中呈现一定特异性，其中CaI处U型扭曲结构顶端第31位氨基酸残基在α、α/β、β/α-CGT酶中主要为丝氨酸（S），在β-、β/γ-CGT酶中主要为丙氨酸（A）;而CaIII仅存在于少数CGT酶中。研究显示，钙离子结合位点处氨基酸残基适当突变能在一定程度上改变CGT酶的环化活力、热稳定性和产物特异性，这可能对于构建具有更高β-环糊精特异性的突变体具有指导意义。其次，通过对来源于B. circulans STB01CGT酶第31位氨基酸残基（Ala31）的适当突变，并将突变cgt基因表达于Bacillus subtilis WB600中，提高了CGT酶的产物特异性。结果显示，Ala31分别突变成精氨酸、脯氨酸和苏氨酸提高了CGT酶的β-环糊精特异性。突变体A31R、A31P和A31T的β-环糊精的产量比野生CGT酶分别提升25.8%、16.1%和9.7%;Ala31突变为丝氨酸提高了CGT酶的α-环糊精特异性;而Ala31突变为谷氨酸提高了CGT酶的γ-环糊精特异性。突变体在β-环糊精特异性上的提高可能是由于突变稳定了钙离子结合位点，从而稳定了CGT酶特定构象，利于β-CGT酶大量生产β-环糊精;而突变体在α-或γ-环糊精特异性上的提高可能是由于该类型突变撞击钙离子和附近氨基酸残基，不利于钙离子结合位点的稳定，降低β-CGT酶生产β-环糊精的能力，而环糊精产物抑制作用的减弱却促进了α-或γ-环糊精的生产。β-CGT酶的突变体N29K、A31G和α-CGT酶的突变体T31A、T31S的构建进一步证实钙离子结合位点稳定性有利于β-CGT酶生产β-环糊精。最后，通过对钙离子结合位点CaIII处第315位进行适当突变发现，该位点突变为亲水性较强的氨基酸残基提高B. circulans STB01CGT酶的β-环糊精特异性，而突变为疏水性或略亲水性氨基酸残基则没有明显变化。突变体A315R和A315D具有较高的β-环糊精生成能力，其β-环化活力比野生CGT酶分别增加12%和10%，最终环化产物中，突变体A315R和A315D的β-环糊精产量比野生CGT酶分别提高15.1%和10.8%;而A315T、A315V和A315I突变对CGT酶产物特异性则没有显著影响。突变体在β-环糊精特异性上的提高可能是亲水性较强的氨酸残基有利于分布在CGT酶表面，且稳定了该处钙离子结合位点的结果。总的来说，具有更高β-环糊精特异性的突变体A315R和A315D可能更适合于β-环糊精的工业化生产。此外，CaIII处Asp577的适当突变也能在一定程度上影响CGT酶的产物特异性，这也说明了钙离子结合位点CaIII对于CGT酶的产物特异性具有重要作用。另外，钙离子结合位点CaI和CaIII处的适当突变均能改变CGT酶对钙离子的响应值，这进一步说明钙离子结合位点对于CGT酶的环化反应是重要的。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶环糊精钙离子结合位点产物特异性定点突变

SETD3和DOT1L催化机制和产物特异性的理论模拟研究

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SETD3和DOT1L催化机制和产物特异性的理论模拟研究

作者：赵圆圆山东农业大学

学位级别：硕士

蛋白质的翻译后修饰(包括甲基化、泛素化、乙酰化等),作为表观遗传学的研究焦点之一,在改变染色质的结构、调控基因的表达以及调节蛋白质的生物功能等方面发挥着重要作用。甲基化修饰作为蛋白质翻译后修饰的一种重要形式,可以调控多种... 详细信息

蛋白质的翻译后修饰(包括甲基化、泛素化、乙酰化等),作为表观遗传学的研究焦点之一,在改变染色质的结构、调控基因的表达以及调节蛋白质的生物功能等方面发挥着重要作用。甲基化修饰作为蛋白质翻译后修饰的一种重要形式,可以调控多种生物进程,如转录沉默和激活、DNA修复和细胞周期控制等。本文在原子/分子水平上,通过系统研究SETD3催化β-肌动蛋白Met73、Lys73甲基化以及DOT1L催化组蛋白H3K79甲基化的动力学性质和能量信息,探讨关键氨基酸残基的突变所引起的酶活性改变的本质原因,进而揭示SETD3和DOT1L的催化机制和产物特异性。具体内容分为以下三部分:(1)SETD3被确认为是β-肌动蛋白中His73-N甲基转移酶,His73的甲基化在调节肌动蛋白的生化特性、微调该蛋白的细胞作用、控制磷酸基团的释放通路等方面起着重要作用。进一步的研究表明,SETD3甲基转移酶还可以使其他一些氨基酸残基发生甲基化,包括Met73和Lys73,即它们取代β-肌动蛋白中的His73。SETD3在Met73上的活性很低,相关实验已经证明SETD3的N255V突变体可以使Met73甲基化的活性增加约3倍,而这种突变导致His73甲基化的k却显著降低。然而,突变后Met73甲基化活性增加的详细机制尚不清楚。本研究基于QM/MM分子动力学模拟(MD)与PMF(Potential of mean force)自由能模拟探究SETD3野生酶(WT)及突变体N255V催化H73M甲基化的结构、动力学和能量特征。模拟结果表明:SETD3野生酶催化蛋氨酸甲基化的自由能垒比组氨酸甲基化高约10 kcal/mol,N255V突变体催化蛋氨酸甲基化的自由能垒比野生酶降低约1 kcal/mol。(2)赖氨酸甲基化可以影响一些基本的生物过程,而甲基化的特定生物效应往往取决于通过甲基转移酶添加到赖氨酸残基上的甲基数量(产物特异性)。β-肌动蛋白中目标残基H73突变为K73后,SETD3对K73也有弱的甲基化活性。由于N255→A或N255→F/W273→A的突变,SETD3催化K73甲基化的活性显著增加,突变体的产物特异性也不同于野生酶。关于活性位点的结构特征和动力学如何影响赖氨酸甲基转移酶的活性和产物特异性的问题仍然存在。本研究采用QM/MM分子动力学模拟和PMF自由能模拟探究SETD3野生酶及突变体N255A、N255F/W273A的催化机制和产物特异性,揭示了关键氨基酸残基的突变影响SETD3酶活性改变的本质原因。结果表明:SETD3野生酶催化K73第一次甲基化的自由能垒高于H73甲基化;野生酶催化K73第二次甲基化的自由能垒相比第一次甲基化明显增加,验证了SETD3是赖氨酸单甲基转移酶;N255A突变体催化K73三次甲基化的自由能垒依次降低,酶活性依次增强,所以N255A被认为是一种赖氨酸三甲基转移酶;K73第一次甲基化的活性顺序为N255F/W273A>N255A>WT,与生化实验结果相一致。(3)DOT1L作为组蛋白H3K79甲基转移酶DOT1的同源蛋白,在哺乳动物中可以催化H3K79发生单、双、三次甲基化。DOT1L对哺乳动物中胚胎形成和造血过程有重要影响,其异常活化与急性白血病息息相关,也是发展药物的一个重要靶点。相关的实验研究表明,DOT1L的催化活性依赖于组蛋白H2BK120单泛素化的协助。组蛋白H4尾部突变体(H4R17A、H4R19A)以及DOT1L loop突变体(F131A、W305A)均影响DOT1L的酶活性。但目前关于DOT1L催化组蛋白H3K79甲基化的反应机制以及关键氨基酸残基的突变改变DOT1L甲基化活性的原因尚不清楚。本研究基于QM/MM分子动力学和PMF自由能模拟,探究DOT1L催化H3K79甲基化的催化机制、关键残基对DOT1L复合物结构的稳定作用及突变体影响酶活性改变的本质原因。结果表明:DOT1L野生酶催化组蛋白H3K79三次甲基化的自由能垒逐渐降低,证明DOT1L是一种赖氨酸三甲基转移酶;H4尾部突变体R17A、R19A催化H3K79第一次甲基化的自由能垒与野生酶第一次甲基化类似,而第二次甲基化的自由能垒明显高于第一次甲基化,酶活性明显减弱;DOT1L loop突变体F131A、W305A催化H3K79第一次甲基化的自由能垒明显高于野生酶,酶活性大大减弱,与生化实验的观察结果相一致。上述模拟结果为进一步认识SETD3、DOT1L的催化机制和产物特异性提供理论依据,并为深入理解表观遗传修饰机制、设计发展有效的药物分子提供新的思路。

关键词： SETD3 DOT1L 催化机制产物特异性蛋氨酸甲基化赖氨酸甲基化 QM/MM分子动力学模拟 PMF自由能模拟

倍半萜合酶催化红没药基焦磷酸的能力及产物特异性

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倍半萜合酶催化红没药基焦磷酸的能力及产物特异性

作者：孙伟皓河北大学

学位级别：硕士

倍半萜合酶通过催化天然底物法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate,FPP)形成法尼基碳正离子,然后进行一系列环化和重排,经碳正离子中间体去质子化、磷酸化或与水淬灭后生成无数倍半萜产物。倍半萜合酶具有底物多样性,除催化(E,E)-FPP外,... 详细信息

倍半萜合酶通过催化天然底物法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate,FPP)形成法尼基碳正离子,然后进行一系列环化和重排,经碳正离子中间体去质子化、磷酸化或与水淬灭后生成无数倍半萜产物。倍半萜合酶具有底物多样性,除催化(E,E)-FPP外,还能催化多种萜烯基焦磷酸底物生成不同产物,倍半萜合酶这种底物的广泛性使其产物具有更大的多样性。为进一步挖掘倍半萜合酶的催化潜力,扩大倍半萜合酶的产物谱,本研究合成了红没药基焦磷酸(Bisabolyl diphosphate,BPP),其焦磷酸基团离去后生成具有单环结构的红没药基碳正离子,红没药基碳正离子是倍半萜合酶催化反应中生成含有分子内C1-6环的反应中间体,因此,本研究推测其可能作为倍半萜合酶的底物。本研究通过17种倍半萜合酶体外催化实验,探究倍半萜合酶对BPP有无催化功能、能产生何种产物。经GC-MS、GC-FID、LC-MS进行产物鉴定和手性分析,同时结合定点突变技术进一步探究倍半萜合酶青蒿(E)-β-法尼烯合酶(Artemisia annua(E)-β-farnesene synthase,Aa BFS)、玉米倍半萜合酶4(Zea mays B73 terpene synthase 4,Zm TPS4)和甜舌草红没药醇合酶(Lippia dulcis(+)-epi-α-bisabolol synthase,Ld BOS)活性中心氨基酸残基对催化FPP、BPP反应的产物特异性影响。实验结果发现:17种倍半萜合酶体外催化BPP皆有产物生成,催化产物多为红没药烯类单环倍半萜,檀香β-没药烯合酶(Santalum austrocalenicumβ-bisabolene synthase,Sa BBS)、高粱(E)-β-法尼烯合酶(Sorghum bicolor(E)-β-farnesene synthase,Sb BFS)等催化BPP结果中还有未知结构产物生成。此外,初步结果表明倍半萜合酶对BPP具有手性选择性,母菊红没药醇合酶(Matricaria recutita(-)-α-bisabolol synthase,Mr BOS)无催化(-)BPP功能。AaBFS-Y402残基在催化不同底物反应中均影响底物的选择和产物特异性,Y402残基的多个突变体丧失(-)BPP催化能力。Y402L突变体增强了催化(Z,E)-FPP反应产物的手性专一性,(R)-β-Bisabolene基本消失。ZmTPS4-Y382和T305位残基不仅影响(E,E)-FPP的二次环化,还影响催化BPP的产物特异性。Y382位点多个突变体催化BPP(mix)生成(S)-β-Bisabolene产物比例增加;T305位点多个突变体催化BPP(mix)产物中(R)-(E)-α-bisabolene基本消失,其中T305A突变体催化(-)BPP生成(S)-(E)-α-bisabolene专一性增强,(Z)-γ-bisabolene消失。LdBOS-Y372和S294位点并非影响催化(E,E)-FPP环化反应的关键位点,但影响催化BPP的产物特异性。Y372位点突变后丧失对(-)BPP的催化功能,S294T突变体催化BPP生成β-Bisabolene产物比例降低。此外,G400Y突变体体外催化(-)BPP生成新产物(Z)-α-bisabolene;A403F突变体催化BPP(mix)无α-bisabolol生成,催化(-)BPP生成(S)-β-Bisabolene产物专一性增强。以上结果表明,本研究合成的红没药基焦磷酸可作为倍半萜合酶的底物,并且倍半萜合酶对BPP具有手性选择性。结合定点突变发现活性中心氨基酸的突变可影响催化FPP和BPP反应的底物选择性和产物特异性。此项工作不仅可以扩展倍半萜合酶底物的应用范围,挖掘倍半萜合酶的催化潜能,还能为倍半萜合酶的理性设计提供新模式。

关键词：倍半萜合酶定点突变非天然底物产物特异性手性分析

Limosilactobacillus reuteri 121 4,6-α-葡萄糖基转移酶GtfB催化产物键型特异性机制研究

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Limosilactobacillus reuteri 121 4,6-α-葡萄糖基转移酶GtfB催...

作者：姜雅文江南大学

学位级别：硕士

Limosilactobacillus reuteri 121 4,6-α-葡萄糖基转移酶(4,6-α-Glucanotransferase,4,6-α-GTase)GtfB是以淀粉/麦芽糊精为底物,形成含有连续非分支(α1→6)键的可溶性膳食纤维——异麦芽/麦芽多糖(IMMP)的新型淀粉酶,具有良好的商业价值。4,6-α-GTase GtfB的晶体结构已经被解析,但对于反应和产物特异性至关重要的受体亚位点氨基酸残基尚未完全确定,其在成键机制中扮演的角色也有待探究。基于以上问题,本论文通过序列比对及晶体结构分析,探究Glycoside hydrolase(GH)70家族保守的同源氨基酸序列中受体亚位点附近的氨基酸残基,通过定点突变的手段构建突变体,并考察突变体的酶活、动力学参数等酶学性质和键型含量及产物特异性的变化,探究受体亚位点附近氨基酸在4,6-α-GTase GtfB催化成键及产物合成过程中的影响。具体研究内容如下:(1)突变位点的选择及突变体的构建表征:选择与N-末端截断的GtfB(GtfB-ΔN)具有高度序列同一性,但具有不同成键类型的4,3-α-GTase为模板,进行序列比对分析,筛选保守氨基酸序列中具有独特序列变异的氨基酸残基,选择位于受体亚位点附近的氨基酸残基并构建突变体I1020M、S1057P、H1056G、Q1126I和I1020M-H1056G-S1057P-Q1126I,以麦芽糊精与麦芽七糖为底物,探究产物(α1→6)键含量变化。结果表明,突变体H1056G及组合突变体I1020M-H1056G-S1057P-Q1126I的酶活性及底物亲和力降低,以麦芽糊精为底物的产物(α1→6)键含量分别下降9%和16%;麦芽七糖为底物的产物(α1→6)键含量分别下降27%和18%。突变体Q1126I底物亲和力升高,以麦芽糊精为底物的产物(α1→6)键含量提高11%。其他突变体(I1020M和S1057P)产物的键型特异性和产物特异性变化较小。因此,位点H1056与Q1126作为后续研究的重点。(2)与受体存在直接氢键作用的关键氨基酸H1056对GtfB-ΔN反应特异性与键型特异性的影响研究:将GtfB-ΔN与麦芽七糖进行分子对接,H1056侧链与麦芽七糖在+2亚位点存在氢键作用。构建并异源表达突变体H1056R、H1056A、H1056V、H1056Y、H1056G、H1056F和H1056Q。突变体最适温度和最适p H不变,仍为40℃和p H 5.0。酶活测定结果表明,其酶活分别为2.32、1.81、2.09、1.55、1.75、1.17和1.72 U/mg,除H1056R外均低于GtfB-ΔN的2.54 U/mg,突变体H1056Y和H1056F酶活损失最高。除突变体H1056R和H1056V外,其余突变体的底物亲和力降低;所有突变体的催化效率(k/K)降低。以麦芽七糖为底物的产物(α1→6)含量分别为44%、33%、29%、29%、26%、26%和33%,除H1056R外均明显低于GtfB-ΔN的53%。结果表明,H1056与底物的氢键相互作用及侧链基团的空间位阻变化都会影响酶活性及其产物连接特异性。(3)与受体结合存在间接作用的关键氨基酸Q1126空间位阻变化对GtfB-ΔN反应特异性与键型特异性的影响研究:将GtfB-ΔN与麦芽七糖进行分子对接,显示Q1126位于底物结合槽中受体结合通道附近。构建并异源表达突变体Q1126F、Q1126V、Q1126R、Q1126Y、Q1126W、Q1126G和Q1126I。突变体最适温度和最适p H不变,仍为40℃和p H 5.0。酶活测定结果表明,其酶活分别为1.78、2.73、1.87、1.48、2.57、1.37和3.32U/mg,除Q1126I、Q1126V和Q1126W外均低于GtfB-ΔN的2.54 U/mg。动力学参数结果表明,Q1126I及Q1126V的K值降低,底物亲和力提高,而其他突变体的催化效率降低。以麦芽七糖为底物的产物(α1→6)含量分别为29%、51%、20%、32%、38%、60%和50%,Q1126G相较于GtfB-ΔN的53%升高。结果表明,受体进入通道附近位点Q1126侧链基团变化使其与底物的空间位阻变化时,会影响酶活性及其产物连接特异性。(4)底物结构对突变体产物键型特异性及大小的影响研究:选择麦芽糊精为第二底物,探究H1056与Q1126位点对于尺寸较大底物的产物键型特异性及尺寸大小的影响。核磁共振结果表明,突变体H1056R、H1056A、H1056V、H1056Y、H1056G、H1056F和H1056Q的产物(α1→6)键含量分别为33%、28%、26%、25%、26%、23%和26%,除H1056R外均低于GtfB-ΔN

关键词： α-葡萄糖基转移酶定点突变键型特异性催化机制产物特异性

环糊精糖基转移酶JSL-1的鉴定及功能研究

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聊城大学学报（自然科学版） 2024年第2期37卷 80-88页

作者：李茹丁欣杰商金海秦林雪魏铠王月李攀聊城大学药学院山东聊城252059

环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)可以通过环化反应催化淀粉及其衍生物生成环糊精(Cyclodextrin,CDs)。研究通过基因工程技术手段,成功获得东洋芽孢杆菌Bacillus toyonensi s P18中环糊精糖基转移酶JSL-1蛋白... 详细信息

环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)可以通过环化反应催化淀粉及其衍生物生成环糊精(Cyclodextrin,CDs)。研究通过基因工程技术手段,成功获得东洋芽孢杆菌Bacillus toyonensi s P18中环糊精糖基转移酶JSL-1蛋白,探讨其产物特异性及酶学性质。同时,将JSL-1基因超表达到日本晴水稻中,研究环糊精糖基转移酶JSL-1对水稻淀粉质量的影响。结果表明,JSL-1主要催化淀粉生成α-CD,其最适反应pH和最适反应温度分别是8.0和50℃。随着JSL-1表达水平的增加,水稻中直链淀粉含量及老化程度下降,透光率及冻融稳定性增加,有利于提高水稻的食味品质以及外观品质等特性。总之,对环糊精糖基转移酶JSL-1的研究有利于环糊精生产工艺的改良以及水稻品质的提升。

关键词：环糊精糖基转移酶产物特异性酶学性质转基因水稻淀粉特性

源于Bacillus megaterium STB10的直链麦芽五糖生成酶酶学性质及其产物合成规律

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食品科学 2022年第10期43卷 73-80页

作者：韩煦班宵逢李才明顾正彪李兆丰江南大学食品学院江苏无锡214122

构建来源于巨大芽孢杆菌STB10直链麦芽五糖生成酶(Bacillus megaterium maltopentaose-forming amylase,BmMFA)的食品级枯草芽孢杆菌表达系统,实现了该酶的分泌表达,分析了其酶学性质,并对其产物合成规律进行了探究。结果显示,BmMFA具... 详细信息

构建来源于巨大芽孢杆菌STB10直链麦芽五糖生成酶(Bacillus megaterium maltopentaose-forming amylase,BmMFA)的食品级枯草芽孢杆菌表达系统,实现了该酶的分泌表达,分析了其酶学性质,并对其产物合成规律进行了探究。结果显示,BmMFA具有较强的催化活力,枯草芽孢杆菌发酵后上清液中酶活力可达196.57 U/mL;该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为7.0,且具有相对较宽的pH值应用范围;BmMFA倾向于内切酶作用机制,且具有较好的产物特异性,水解麦芽糊精24 h后产物中直链麦芽五糖质量分数42%以上,当以支链淀粉为底物时,其转化率及主产物直链麦芽五糖比例均优于直链淀粉。本研究为直链麦芽五糖的酶法制备提供了一定的理论依据。

关键词：直链麦芽五糖直链麦芽五糖生成酶酶学性质产物合成产物特异性

具有极高热稳定性的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶的挖掘、鉴定及应用

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食品与生物技术学报 2023年第4期42卷 57-68页

作者：张晓琦徐炜倪大伟张文立光翠娥沐万孟食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡214122 江南大学食品安全国际合作联合实验室江苏无锡214122

挖掘具有高热稳定性的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶(levansucrase,LS)并进行β-(2,6)果聚糖的高效合成。以分子动力学模拟的方式筛选出具有潜在高热稳定性的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶。将目的酶在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行重组及... 详细信息

挖掘具有高热稳定性的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶(levansucrase,LS)并进行β-(2,6)果聚糖的高效合成。以分子动力学模拟的方式筛选出具有潜在高热稳定性的β-(2,6)果聚糖蔗糖酶。将目的酶在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行重组及诱导表达,并通过镍柱亲和层析进行纯化。在不同温度下进行保温实验以验证LS的热稳定性,并通过条件优化获得产物的高转化率。Cedi-LS在65℃时显示出最高活性,远高于已鉴定的其他LS。同时,在45℃下保温72 h,重组酶Cedi-LS能够保留90%以上的相对活性;在55℃下保温60 h,其保留活性仍可达到初始活性的60%以上,表现出优异的热稳定性。在反应过程中,Cedi-LS可同时生成低聚糖、低相对分子质量的β-(2,6)果聚糖和高相对分子质量的β-(2,6)果聚糖。当温度从65℃降至35℃时,Cedi-LS倾向于产生HMW-levan,其相对分子质量可达8.4×10^(6)。在pH 5.5和35℃的条件下,以质量分数30%的蔗糖为底物,加酶量为20μg/mL,蔗糖转化为β-(2,6)果聚糖的平衡转化率为41.4%。作者挖掘了一株具有高热稳定性的LS,其能够高效生产一系列具有不同相对分子质量的果聚糖。

关键词： β-(2,6)果聚糖蔗糖酶热稳定性 β-(2,6)果聚糖产物特异性

R262K点突变将紫穗槐二烯合酶变为(3R)-(E)-nerolidol合酶

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河北农业大学学报 2015年第3期38卷 12-18页

作者：李振秋高瑞平程隆斌刘秀华朱华结河北大学生命科学学院河北保定071002 河北大学药学院河北保定071002

倍半萜合酶家族催化单一底物法尼基焦磷酸形成近300多种链式、单环、双环和三环倍半萜烯、醇,进一步的加工修饰产生种类更加繁多的倍半萜衍生物。详细了解倍半萜合酶产物特异性性决定机制将会为倍半萜合酶的理性设计,定向生成新型化合... 详细信息

倍半萜合酶家族催化单一底物法尼基焦磷酸形成近300多种链式、单环、双环和三环倍半萜烯、醇,进一步的加工修饰产生种类更加繁多的倍半萜衍生物。详细了解倍半萜合酶产物特异性性决定机制将会为倍半萜合酶的理性设计,定向生成新型化合物打下基础。本研究利用定点突变技术,对紫穗槐二烯合酶RxR基序及相关的D300位点进行了点突变,发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(3R)-(E)-nerolidol,而R262L突变使酶失去活性,R264K突变则对产物比例无影响,显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要,结合R262突变结果,推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。由于RxR基序在倍半萜合酶家族中非常保守,因此其作用是否具有普遍性值得进一步验证。

关键词：倍半萜合酶紫穗槐二烯合酶 (3R)-(E)-nerolidol合酶定点突变产物特异性