Limosilactobacillus reuteri 121 4,6-α-葡萄糖基转移酶GtfB催化产物键型特异性机制研究

作     者：姜雅文 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：柏玉香

授予年度：2022年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：α-葡萄糖基转移酶 定点突变 键型特异性 催化机制 产物特异性 

摘      要：Limosilactobacillus reuteri 121 4,6-α-葡萄糖基转移酶(4,6-α-Glucanotransferase,4,6-α-GTase)GtfB是以淀粉/麦芽糊精为底物,形成含有连续非分支(α1→6)键的可溶性膳食纤维——异麦芽/麦芽多糖(IMMP)的新型淀粉酶,具有良好的商业价值。4,6-α-GTase GtfB的晶体结构已经被解析,但对于反应和产物特异性至关重要的受体亚位点氨基酸残基尚未完全确定,其在成键机制中扮演的角色也有待探究。基于以上问题,本论文通过序列比对及晶体结构分析,探究Glycoside hydrolase(GH)70家族保守的同源氨基酸序列中受体亚位点附近的氨基酸残基,通过定点突变的手段构建突变体,并考察突变体的酶活、动力学参数等酶学性质和键型含量及产物特异性的变化,探究受体亚位点附近氨基酸在4,6-α-GTase GtfB催化成键及产物合成过程中的影响。具体研究内容如下:(1)突变位点的选择及突变体的构建表征:选择与N-末端截断的GtfB(GtfB-ΔN)具有高度序列同一性,但具有不同成键类型的4,3-α-GTase为模板,进行序列比对分析,筛选保守氨基酸序列中具有独特序列变异的氨基酸残基,选择位于受体亚位点附近的氨基酸残基并构建突变体I1020M、S1057P、H1056G、Q1126I和I1020M-H1056G-S1057P-Q1126I,以麦芽糊精与麦芽七糖为底物,探究产物(α1→6)键含量变化。结果表明,突变体H1056G及组合突变体I1020M-H1056G-S1057P-Q1126I的酶活性及底物亲和力降低,以麦芽糊精为底物的产物(α1→6)键含量分别下降9%和16%;麦芽七糖为底物的产物(α1→6)键含量分别下降27%和18%。突变体Q1126I底物亲和力升高,以麦芽糊精为底物的产物(α1→6)键含量提高11%。其他突变体(I1020M和S1057P)产物的键型特异性和产物特异性变化较小。因此,位点H1056与Q1126作为后续研究的重点。(2)与受体存在直接氢键作用的关键氨基酸H1056对GtfB-ΔN反应特异性与键型特异性的影响研究:将GtfB-ΔN与麦芽七糖进行分子对接,H1056侧链与麦芽七糖在+2亚位点存在氢键作用。构建并异源表达突变体H1056R、H1056A、H1056V、H1056Y、H1056G、H1056F和H1056Q。突变体最适温度和最适p H不变,仍为40℃和p H 5.0。酶活测定结果表明,其酶活分别为2.32、1.81、2.09、1.55、1.75、1.17和1.72 U/mg,除H1056R外均低于GtfB-ΔN的2.54 U/mg,突变体H1056Y和H1056F酶活损失最高。除突变体H1056R和H1056V外,其余突变体的底物亲和力降低;所有突变体的催化效率(k/K)降低。以麦芽七糖为底物的产物(α1→6)含量分别为44%、33%、29%、29%、26%、26%和33%,除H1056R外均明显低于GtfB-ΔN的53%。结果表明,H1056与底物的氢键相互作用及侧链基团的空间位阻变化都会影响酶活性及其产物连接特异性。(3)与受体结合存在间接作用的关键氨基酸Q1126空间位阻变化对GtfB-ΔN反应特异性与键型特异性的影响研究:将GtfB-ΔN与麦芽七糖进行分子对接,显示Q1126位于底物结合槽中受体结合通道附近。构建并异源表达突变体Q1126F、Q1126V、Q1126R、Q1126Y、Q1126W、Q1126G和Q1126I。突变体最适温度和最适p H不变,仍为40℃和p H 5.0。酶活测定结果表明,其酶活分别为1.78、2.73、1.87、1.48、2.57、1.37和3.32U/mg,除Q1126I、Q1126V和Q1126W外均低于GtfB-ΔN的2.54 U/mg。动力学参数结果表明,Q1126I及Q1126V的K值降低,底物亲和力提高,而其他突变体的催化效率降低。以麦芽七糖为底物的产物(α1→6)含量分别为29%、51%、20%、32%、38%、60%和50%,Q1126G相较于GtfB-ΔN的53%升高。结果表明,受体进入通道附近位点Q1126侧链基团变化使其与底物的空间位阻变化时,会影响酶活性及其产物连接特异性。(4)底物结构对突变体产物键型特异性及大小的影响研究:选择麦芽糊精为第二底物,探究H1056与Q1126位点对于尺寸较大底物的产物键型特异性及尺寸大小的影响。核磁共振结果表明,突变体H1056R、H1056A、H1056V、H1056Y、H1056G、H1056F和H1056Q的产物(α1→6)键含量分别为33%、28%、26%、25%、26%、23%和26%,除H1056R外均低于GtfB-ΔN