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环糊精糖基转移酶定点突变及其产物特异性分析

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食品科学 2016年第17期37卷 133-138页

作者：凌凯张洪斌刘鹏飞胡雪芹合肥工业大学生物与医学工程学院安徽合肥230009

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)是一种多功能酶,能够催化淀粉生成环糊精(cyclodextrin,CD),本研究考察了Bacillus cereus的CGTase活性区域43位氨基酸与CGTase酶活力及其催化玉米淀粉形成γ-CD能力的联系。实验中共构建17株突变株,并在大肠杆菌BL21中实现异源表达。结果表明:相比于原始酶,H43E、H43F、H43W、H43Y突变酶的活力均有所提高;产物特异性方面,除H43W突变酶外,其余突变酶的催化产物中γ-CD比例均有所升高,将43位组氨酸突变成脯氨酸、异亮氨酸和苏氨酸后得到的突变酶作用于玉米淀粉,酶的催化产物中β-CD含量均下降,γ-CD含量由20%分别升高到30.2%、28.4%、29.2%,实际产量由4.76 g/L升高到7.64、6.05、6.29 g/L,由此可见Bacillus cereus的CGTase活性区域中43位氨基酸对于CGTase的活力和产物特异性具有重要影响。

关键词：环糊精糖基转移酶定点突变产物特异性

亚位点7处突变对碱性芽胞杆菌CGT酶产物特异性的影响

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生物工程学报 2012年第2期28卷 191-202页

作者：杨冬田靖斐陈晟吴敬江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

为了研究来源于碱性芽胞杆菌的γ-环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)具有较高产物特异性的作用机理,对其氨基酸序列和模拟结构进行了分析,确定其亚位点7处氨基酸的缺失可能影响其产物特异性。运用重叠PCR的方法,在其亚位点7处添加缺失的6个... 详细信息

为了研究来源于碱性芽胞杆菌的γ-环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)具有较高产物特异性的作用机理,对其氨基酸序列和模拟结构进行了分析,确定其亚位点7处氨基酸的缺失可能影响其产物特异性。运用重叠PCR的方法,在其亚位点7处添加缺失的6个氨基酸,造成插入突变。将突变基因与pET-20b(+)连接并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。以可溶性淀粉为底物进行酶转化,HPLC分析转化产物中的环糊精含量。结果表明,相对于野生型γ-CGT酶,突变酶转化生成的3种环糊精中,γ-环糊精所占的比例从76.0%降至12.5%,α-、β-环糊精分别从8.7%和15.2%提高至37.5%和50%。分析其可能机理为:与α-、β-CGT酶相比,野生型γ-CGT酶的亚位点7处缺失6个氨基酸,该构象为葡萄糖的结合提供了更大的空间,从而更适合γ-环糊精的生成;而在其亚位点7处插入6个氨基酸,造成插入突变后,葡萄糖链结合的空间变小,这种构象不利于γ-环糊精的生成。

关键词：环糊精环糊精葡萄糖基转移酶产物特异性突变

γ-环糊精葡萄糖基转移酶的酶学性质及其产物特异性

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食品与发酵工业 2022年第13期48卷 25-32页

作者：陶志杰杨静文王清晨吴元元胡雪芹张洪斌蚌埠学院食品与生物工程学院安徽蚌埠233030 合肥工业大学食品与生物工程学院安徽合肥230009

通过克隆Bacillus clarkii 7364来源编码γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-cyclodextrins glucanotransferase,γ-CGTase)的基因,构建并表达基因重组菌株*** BL21/pET28a(+)-γ-CGTase,对γ-CGTase酶学性质和产物特异性进行了研究。结果表明,所克隆表达的γ-CGTase分子质量为78 kDa,水解活力与环化活力在最适温度、最适pH、金属离子影响等方面均存在一定差异。以可溶性淀粉为底物,经HPLC测定催化产物中几乎无α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD),γ-CD/β-CD可达7.70,γ-CD转化率为15.83%,添加体积分数为10%的乙醇浓度γ-CD产量可提高89.91%,γ-CD/β-CD提高73.77%,转化率为33.44%。催化豌豆淀粉γ-CD/β-CD达12.92,转化率为19.1%,分别比可溶性淀粉提高了63.13%和22.90%。该研究为进一步提高γ-CGTase酶法制备γ-CD产量和专一性应用提供了重要的理论依据。

关键词： γ-环糊精葡萄糖基转移酶 γ-环糊精酶学性质产物特异性

γ-CGTase酶学性质及产物特异性影响因素

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食品与发酵工业 2020年第5期46卷 38-45页

作者：郑丹妮柏玉香纪杭燕李晓晓王禹蔣彤金征宇江南大学食品学院江苏无锡214122 食品科学与技术国家重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

将γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)的特有区域作为判断依据,在美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中,通过序列比对及生物信息学分析,筛选出一种新型基因,并将其克隆表达得到一种酶。... 详细信息

将γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)的特有区域作为判断依据,在美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中,通过序列比对及生物信息学分析,筛选出一种新型基因,并将其克隆表达得到一种酶。利用高效液相色谱-质谱联用进行产物鉴定,表明该酶为γ-CGTase;酶分子质量大约为80 kDa,最适温度50℃,最适pH 10.0;无α-环糊精生成;甲醇、乙醇、环己烷、十二醇激活γ-CGTase活力,异丙醇和正丁醇抑制γ-CGTase活力;反应时间、淀粉质量浓度及乙醇体积分数均会影响γ-CGTase的产物特异性。HPLC结果显示,在10%的乙醇最终体积分数条件下,γ-CGTase催化产物中γ-环糊精的比例由40.11%增加至78.20%,专一性提高了94.96%。该研究提供了一种新型的γ-CGTase,为提高γ-CGTase产物特异性提供研究基础。

关键词： γ-环糊精葡萄糖基转移酶酶学性质乙醇产物特异性

Geobacillus ***1环糊精葡萄糖基转移酶淀粉结合位点N623饱和突变对催化效率与产物特异性的影响

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中国生物工程杂志 2016年第11期36卷 30-38页

作者：郭永华陈济琛蔡海松陈龙军林新坚福建省农业科学院土壤肥料研究所福州350003 福建农林大学生命科学学院福州350002

为了提高来源于Geobacillus ***1环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的催化效率和产物特异性,对其氨基酸序列和模拟结构进行了分析,确定其淀粉结合位点2处第623位氨基酸残基的构象可能影响其催化效率。运用重叠PCR技术,在其淀粉结合位点2处第... 详细信息

为了提高来源于Geobacillus ***1环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的催化效率和产物特异性,对其氨基酸序列和模拟结构进行了分析,确定其淀粉结合位点2处第623位氨基酸残基的构象可能影响其催化效率。运用重叠PCR技术,在其淀粉结合位点2处第623位(N623)进行定点饱和突变,构建19种不同氨基酸残基突变体。将突变基因与p ET-28a(+)-omp A载体连接并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。以可溶性淀粉为底物进行酶催化实验,HPLC分析反应产物中的环糊精含量变化。结果表明,相对于野生型CGTase,突变酶N623T的催化效率明显提高,总环化活力提高了58.6%,α-环化活力提高了64%,β-环化活力提高了80.5%,而γ-环化活力降低了35.3%。产物特异性方面,相比野生型CGTase,突变酶N623T的淀粉总转化率从11.3%提高至39.7%,提高了251.3%,其中α-环糊精、γ-环糊精所占比例缩减为32.8%和7.7%,β-环糊精提高至59.5%。分析其可能机制为:与野生型CGTase相比,突变体N623T中苏氨酸残基代替了天冬酰胺,造成淀粉结合位点2处的构象发生了变化,该构象优化底物作用方向有利于反应的进行,从而提高了酶的催化效率。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶饱和突变催化效率产物特异性

大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变

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基因组学与应用生物学 2011年第5期30卷 556-563页

作者：周兴韦星明杨祥开郑元涛庞浩许黎明黄日波广西大学生命科学与技术学院南宁530005 广西科学院生物研究所南宁530007 生物质能源酶解技术国家重点实验室广西科学院南宁530007

大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖,具有一个可能控制产物特异性的325RLDRD329基序。本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变,共构建R325D、R328A、R328D、R328Q和D329N5个... 详细信息

大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖,具有一个可能控制产物特异性的325RLDRD329基序。本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变,共构建R325D、R328A、R328D、R328Q和D329N5个突变体。通过对突变体的酶学特性及突变体转化蔗糖的产物组成分析,结果显示所构建突变体的Km值上升约2～5倍,比活力下降至野生型SI比活力的11.8%～25.3%。HPLC分析显示Arg325和Arg328分别突变为Asp,导致产物中异麦芽酮糖/海藻酮糖的比例从6.93分别降至0.96和2.92,并伴随一个未知寡糖出现。Arg328突变为Ala和Gln同样导致反应产物中海藻酮糖比例上升,异麦芽酮糖比例下降。但是突变体D329N反应产物比例没有变化。以上结果表明325RLDRD329基序对大黄欧文氏菌蔗糖异构酶的酶活具有重要作用,并对酶的产物特异性产生影响。本研究结果将为该酶的作用机理研究奠定基础。

关键词：蔗糖异构酶定点突变产物特异性大黄欧文氏菌

CGTase产生菌株的筛选及产物特异性分析

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CGTase产生菌株的筛选及产物特异性分析

作者：刘会杰天津科技大学

学位级别：硕士

环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGTase,EC 2.***.1.19)是一种能够通过分子内转糖基化反应作用于淀粉及相关基质合成环糊精的胞外酶。随着环糊精(CD)在活性小分子药物包埋、药用糖的增稠剂和稳定剂、冲剂的赋形剂等生物制药领域的广泛应用,CGT... 详细信息

环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGTase,EC 2.***.1.19)是一种能够通过分子内转糖基化反应作用于淀粉及相关基质合成环糊精的胞外酶。随着环糊精(CD)在活性小分子药物包埋、药用糖的增稠剂和稳定剂、冲剂的赋形剂等生物制药领域的广泛应用,CGTase已经成为当今研究的热点。本研究首先从富含淀粉的土样中,根据环糊精包埋甲基橙和酚酞使培养基颜色发生变化的原理,筛选变色圈较大的20株菌,通过复筛选出酶活力较高的3株菌,之后对酶活力最高的菌株L-1进行16S rDNA和Biolog鉴定,鉴定的结果显示L-1为多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa),将其命名为Paenibacilluspolymyxa TCCC 11934。通过对多粘类芽胞杆菌发酵条件的优化,确定了Paenibacilluspolymyxa TCCC 11934发酵的最适温度37℃和初始pH7.0。以TB为发酵培养基,在37℃,初始pH 7.0的条件下摇瓶发酵60h,发酵液中的酶活达到最高,α-CD、β-CD、γ-CD的酶活力分别为 0.32 U/mL、0.63 U/mL、0.41 U/mL。同时构建了来源于多粘类芽胞杆菌的CGTase在大肠中表达的重组菌株,实现了CGTase在大肠杆菌中的高效表达,在发酵培养基中,37℃培养,当菌体浓度OD600达到0.8时,加入终浓度为0.02mMIPTG,25℃诱导60h后发酵液中CGTase酶活达到8.2U/mL,与天然菌株所分泌的胞外酶活力相比,提高了近12倍。对酶学性质进行研究,结果显示CGTase的最适反应温度为60℃,最适反应pH为7.0,最适反应底物浓度为2%,Km值为0.427 g/L,最大反应速度Vmax=9.17 mM。由于CGTase的热稳定性较差,不能满足工业生产对于较高温度条件下的应用,本论文对Ala315位点的氨基酸进行定点突变以研究该酶的热稳定性。结果显示,不同突变体对CGTase热稳定性的影响存在明显差异,当温度为70℃时,突变体315Asp(D)、315Arg(R)、315His(H)、315Ser(S)均可以提高酶的热稳定性,70℃时 CGTase的半衰期分别延长了 0.5-1.8倍,其中A315D的作用效果最好,相对于野生型而言半衰期延长了 188%。产物特异性差是目前限制CGTase工业化大规模生产的另一个重要因素,本论文通过对已经报道的CGTase序列比对和蛋白结构的分析,发现在CGTase底物结合区和酶催化活力中心附近的氨基酸Tyr(Y)100、Ser(S)145、Tyr(Y)195和His(H)233可能影响产物的特异性。通过对这些位点进行定点突变,结果显示这些氨基酸残基适当改变能在一定程度上影响CGTase的产物特异性。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶 Paenibacillus polymyxa 热稳定性产物特异性定点突变

碱性芽孢杆菌γ-环糊精葡萄糖基转移酶的产物特异性及晶体结构初步研究

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碱性芽孢杆菌γ-环糊精葡萄糖基转移酶的产物特异性及晶体结构初...

作者：杨冬江南大学

学位级别：硕士

环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin Glycosyltransferase,简称CGT酶,EC 2.***.1.19）能通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于环糊精可与疏水性客体分子形成包合物,因此被广泛应用于食品、医药等领域。然而利用野生型CGT酶生... 详细信息

环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin Glycosyltransferase,简称CGT酶,EC 2.***.1.19）能通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于环糊精可与疏水性客体分子形成包合物,因此被广泛应用于食品、医药等领域。然而利用野生型CGT酶生产的均是α-、β-、γ-环糊精的混合物,需通过一系列的步骤才能从混合物中分离纯化出单一类型的环糊精,导致其生产成本高,限制了其大规模应用。为了研究CGT酶产物特异性的分子机制,选用产物特异性高的碱性芽孢杆菌γ-CGT酶为研究对象,将其在Escherichia coli BL21（DE3）中进行了胞外表达,然后对亚位点-7处6个氨基酸的缺失对产物特异性的影响进行了分析。为了深入研究γ-CGT酶三维结构与产物特异性之间的关系,通过X-衍射晶体学的方法对其结构进行了初步解析。主要研究内容如下: （1）将γ-CGT酶基因与带有OmpA信号肽的质粒pET-20b（+）连接,构建表达载体pET-20b（+）/γ-cgt,并将其转入表达宿主E. coli BL21 （DE3）。E. coli BL21 （DE3）（pET-20b （+）/γ-cgt）在TB培养基,25℃,200 rpm摇瓶发酵72 h后,其胞外环化活力为4 U/mL。（2）重组γ-CGT酶带有6×His标签,因此先使用镍离子亲和色谱柱进行纯化,但目的蛋白不能有效地结合到色谱柱上。选用阴离子交换和疏水相互作用色谱柱对目的蛋白进行分离纯化,最终得到了电泳纯蛋白。（3）运用重叠PCR的方法,在γ-CGT酶亚位点-7处添加6个氨基酸,造成插入突变。将突变基因与pET-20b（+）连接并在E. coli BL21（DE3）中表达。对其突变前后产物特异性进行分析发现,突变酶转化生成的3种环糊精中,γ-环糊精所占的比例从76.0%降至12.5%,而α-、β-环糊精分别从8.7%和15.2%提高至37.5%和50%。（4）在20℃条件下采用座滴气相扩散法进行晶体的培养和筛选,通过初筛和复筛,最终得到两种晶型较好的晶体。在上海同步衍射中心收集到一套分辨率为1.65?的衍射数据,用HKL2000进行数据处理,然后运用分子置换法,成功解析得到γ-CGT酶的晶体结构。（5）解析得到的γ-CGT酶晶体结构与蛋白质结构数据库中保存的CGT酶结构进行比对发现,在亚位点-7处,β-CGT酶的环状结构较大,而γ-CGT酶的环状结构较小。突变前,野生型γ-CGT酶亚位点-7处较小的环状结构使得底物结合凹槽空间较大,从而为较长葡萄糖链的结合提供了足够的空间,因此这种构象更适合于γ-环糊精的生成。突变后,这6个氨基酸会与相应的葡萄糖残基相互作用,使得葡萄糖链所能结合的空间变小,从而限制了较长葡萄糖链的结合,因此这种构象不利于γ-环糊精的生成。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶环糊精蛋白质结构产物特异性定点突变

活性中心α螺旋连接处突变对两种倍半萜合酶产物特异性的影响

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活性中心α螺旋连接处突变对两种倍半萜合酶产物特异性的影响

作者：季小龙河北大学

学位级别：硕士

倍半萜合酶能催化单一线性底物法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate,FPP)产生300多种具有不同立体结构的碳氢骨架,这些基本的碳氢骨架在生物体内进一步修饰形成上万种倍半萜化合物。倍半萜化合物在植物次生代谢中起着十分重要的作用,如... 详细信息

倍半萜合酶能催化单一线性底物法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate,FPP)产生300多种具有不同立体结构的碳氢骨架,这些基本的碳氢骨架在生物体内进一步修饰形成上万种倍半萜化合物。倍半萜化合物在植物次生代谢中起着十分重要的作用,如保护植物免受捕食者、病原体、竞争者的侵害等,它们也广泛应用于农药、香料和调味剂等领域中,其中具有多种药理活性,如抗细菌、抗真菌和抗肿瘤等。相关研究表明,活性中心α螺旋连接处氨基酸对于倍半萜合酶催化至关重要,特定氨基酸突变后会改变酶的催化机制,从而导致产物特异性发生变化。这种特异性变化是否引起了产物手性结构的改变目前还没有学者关注到,而催化产物的手性变化对于研究倍半萜合酶十分关键。对倍半萜合酶活性中心α螺旋连接处氨基酸的突变研究能够阐明氨基酸序列与产物、蛋白结构与功能之间的关系,进一步理解倍半萜合酶产物特异性决定机制以及倍半萜合酶催化机制。本课题以来源不同的两种倍半萜合酶为研究对象,檀香红没药烯合酶(Santalum austrocalenicumβ-bisabolene synthase,Sa BBS)和甜舌草红没药醇合酶(Lippia dulcis bisabolol synthase,Ld BOS)。通过定点突变技术,对Sa BBS和Ld BOS活性中心α螺旋连接处进行定点突变,亲和层析纯化突变体蛋白,体外催化化学合成底物FPP以及中间体橙花叔基焦磷酸(Nerolidyl diphosphate,NPP),气相色谱(GC-FID)和气相质谱(GC-MS)分析催化产物,手性分析确定产物构型。实验结果发现,Sa BBS第426、429位氨基酸突变会影响产物特异性。Sa BBSF426G、S429G、S429A三个突变体催化生成的产物α-Bisabolol明显增多,产生新的副产物α-Bisabolene,手性分析显示α-Bisabolol构型未发生变化。Sa BBSF426G单点突变将β-Bisabolene synthase变为(-)-epi-α-Bisabolol synthase。Sa BBSS429F突变体导致(S)-β-Bisabolene大量减少,α-Bisabolol消失,生成了更为复杂的副产物β-Sesquiphellandrene、Sesquisabinene B。Ld BOS第400、403位氨基酸突变也会影响产物特异性。Ld BOS-G400F、G400Y、A403F三个突变体会使α-Bisabolol减少,二次环化产物Sesquisabinene B明显增多,有趣的是,手性分析结果表明α-Bisabolol构型发生改变,突变后催化底物生成两种构型的α-Bisabolol。结果表明,活性中心α螺旋连接处氨基酸突变会影响倍半萜合酶去质子化、氢离子转移、二次环化能力,改变酶的区域选择性。对于催化过程中能同时产生(S)-Bisabolyl cation和(R)-Bisabolyl cation(S-没药基碳正离子、R-没药基碳正离子)两种中间体的Ld BOS,突变会引起(S)-Bisabolyl cation和(R)-Bisabolyl cation相对形成比例发生变化,且由于活性空腔形状发生改变,水分子从两侧进攻Bisabolyl cation,导致催化产生两种构型的α-Bisabolol。

关键词：倍半萜合酶定点突变产物特异性手性分析催化机制