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甜菜BvPCNA基因RNAi载体构建

中国糖料 2024年第2期46卷 9-16页

作者：王希张西宁陶艳昵张琦李志烨赵春雷陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳745000 甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室甘肃庆阳745000 黑龙江大学现代农业与生态环境学院/中国农业科学院甜菜研究所哈尔滨150080 黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江省甜菜工程技术研究中心哈尔滨150080 国家糖料改良中心/中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室哈尔滨150080

【目的】增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在植物中广泛存在,但是其在植物中的功能研究较少。本研究可以为BvPCNA-like基因的功能分析奠定基础。【方法】课题组前期在甜菜基因组中克隆获得一个基因位点,命名为... 详细信息

【目的】增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在植物中广泛存在,但是其在植物中的功能研究较少。本研究可以为BvPCNA-like基因的功能分析奠定基础。【方法】课题组前期在甜菜基因组中克隆获得一个基因位点,命名为BvPCNA-like基因,本研究以BvPCNA-like基因的克隆载体为初始材料,选取适宜的靶序列,利用植物表达载体pFGC5941作为基础载体,使靶序列上游启动子为35 S,植物筛选标记为抗除草剂基因BlpR,设计靶序列特异性引物,采取PCR-酶切-连接方法,构建BvPCNA-RNAi载体。【结果】通过RCR鉴定表明已获得了预期目标载体,插入片段由正向靶序列BvPCNA-F、中间片段、反向靶序列BvPCNA-R组成,靶序列长度为320 bp。【结论】本研究所得载体适用于对双子叶植物进行遗传转化,可以作为BvPCNA-like基因理论研究或应用研究的载体材料。

关键词：甜菜 BvPCNA-like RNAi 载体构建

甜菜BvNLP2-like基因编码区结构分析与原核表达体系建立

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甜菜BvNLP2-like基因编码区结构分析与原核表达体系建立

作者：荆凯黑龙江大学

学位级别：硕士

甜菜作为我国北方主栽的糖料作物,其基因资源尚比较缺乏。在课题组前期工作中,自甜菜基因组中获得了一个与甜菜多粒性状相关的分子标记位点,并已获得国家发明专利(ZL 2018 1 1319502.5),且从甜菜基因组中克隆了标记附近的基因位点,预测... 详细信息

甜菜作为我国北方主栽的糖料作物,其基因资源尚比较缺乏。在课题组前期工作中,自甜菜基因组中获得了一个与甜菜多粒性状相关的分子标记位点,并已获得国家发明专利(ZL 2018 1 1319502.5),且从甜菜基因组中克隆了标记附近的基因位点,预测其编码一个NLP基因并将基因命名为BvNLP2-like。本研究首先以该基因位点为起始材料,以c DNA为模板,通过基因克隆获得完整确切的编码区序列(coding sequence,CDS);对编码区在基因位点中的结构进行分析,结合所得序列与前期的分析结果预测基因剪接位点,并设计方案通过实验进行验证;利用得到的准确核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析,设计合适的酶切位点与融合读码框,构建基因的原核表达载体;将鉴定正确的原核表达载体转化至大肠杆菌,并优化培养、诱导、SDS-PAGE电泳等反应条件,建立适合目的基因的原核表达体系。通过本研究,将对BvNLP2-like基因的序列与结构特征有进一步的认识,并为该基因的功能分析研究奠定基础。主要研究结果如下:(1)克隆了BvNLP2-like基因编码区,得到了该基因完整的ORF序列,长度为2877 bp,编码产物长度为958 aa,基因属于NIN样蛋白(NIN-like protein,NLP)基因家族。(2)对所得的BvNLP2-like基因编码区进行了结构分析,并设计不同的验证策略对剪接位点进行了验证。根据在线软件分析与PCR实验验证,发现该目的序列含有2个剪接位点,包含了3个外显子和2个内含子。(3)对编码区所翻译的氨基酸序列进行了生物信息学分析。结果显示甜菜BvNLP2-like基因编码蛋白BvNLP2-like相对分子质量为104.463 k D,理论等电点为10.48,其分子式CHNOS,在氨基酸水平上,推断出该基因编码蛋白没有明显的跨膜结构域,有可能是亲水性蛋白,有位于细胞核的可能性,蛋白功能与NLP基因家族一致。(4)构建了原核表达载体pET21a-NLP1,并对BvNLP2-like基因表达实验参数进行了优化,建立了基因的原核表达体系。初步确定了蛋白最佳诱导条件为37℃,24 h,IPTG终浓度为0.5 mM。

关键词：甜菜 NIN样蛋白(NLP) 基因克隆编码区结构验证原核表达

甜菜叶绿素a-b结合蛋白基因BvLhcb-2的克隆与表达特性初步分析

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甜菜叶绿素a-b结合蛋白基因BvLhcb-2的克隆与表达特性初步分析

作者：黄春雪黑龙江大学

学位级别：硕士

甜菜(Beta vulgaris L.)是一种重要的糖料作物,为促进甜菜产业的发展,除了通过一些常规的栽培与育种手段之外,还可以从分子水平入手,通过对基因的操作实现性状改良。然而目前我国甜菜的基因资源并不丰富,如何获取足够的基因资源已经成... 详细信息

甜菜(Beta vulgaris L.)是一种重要的糖料作物,为促进甜菜产业的发展,除了通过一些常规的栽培与育种手段之外,还可以从分子水平入手,通过对基因的操作实现性状改良。然而目前我国甜菜的基因资源并不丰富,如何获取足够的基因资源已经成为当前甜菜育种研究中的一个重要课题。本次研究在课题组前期工作的基础上,对甜菜不同叶色种质中的差异表达转录本进行了分析,选取了一个甜菜叶绿素a-b结合蛋白基因为目的基因,将其命名为BvLhcb-2,通过巢式PCR技术对目的基因的编码区片段及其在基因组中的完整基因位点片段分别进行了克隆,得到目的基因的确切序列后,再对其进行生物信息学分析与表达特性分析。初步分析对甜菜叶色有影响的干旱、弱光、衰老条件对BvLhcb-2表达的影响。通过本次研究,将进一步丰富甜菜基因资源。研究结果可提供一些叶色调控与光合作用方面的信息,为后续科研及应用提供相关的理论依据。主要研究结果如下:(1)对BvLhcb-2基因进行了克隆并对其序列完整性进行了验证。通过引物设计、巢式PCR扩增、克隆载体构建与测序等一系列步骤,获得了一条长度为804bp的序列,通过ORF finder和Blast X在线软件确定了该序列的完整性。目的基因在基因组中的序列结构与m RNA中相同,编码区无内含子。(2)对BvLhcb-2基因及其编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。通过对BvLhcb-2基因进行分析,发现其与甜菜叶绿素a-b结合蛋白基因具有很高的相似性。通过对BvLhcb-2蛋白进行分析,推断该蛋白属于叶绿素a-b结合超家族,编码产物长度为267aa,分子质量为28286.31,等电点为5.16,没有跨膜区,具有亲水性,无信号肽,共有18个磷酸化位点。(3)对BvLhcb-2基因进行了表达特性分析。共设置了干旱、遮光、脱落酸、乙烯四组处理,首先通过预备试验分析了不同处理下甜菜外部形态特征及叶绿素含量的变化,再利用荧光定量PCR技术分别分析了不同处理下BvLhcb-2基因在甜菜不同种质中的表达模式。结果表明,不同处理下,基因在2份种质中的变化趋势不同。干旱处理下,BvLhcb-2基因表达先升后降,复水后,基因在‘J9451’中表达下调,而在‘DZ-6’中则显著上调;遮光处理下,基因在‘J9451’中先降后升,而在‘DZ-6’中则先升后降;脱落酸和乙烯处理下,基因在‘J9451’中总体呈现下降趋势,而在‘DZ-6’中总体呈现先升后降趋势。

关键词：甜菜叶色基因克隆生物信息学分析表达特性分析

甜菜标记位点BvRE049相关基因的电子克隆与编码区结构分析

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甜菜标记位点BvRE049相关基因的电子克隆与编码区结构分析

作者：申子萌黑龙江大学

学位级别：硕士

甜菜(Beta vulgaris L.)是我国重要的糖料作物,甜菜基因资源是开展一切分子机制研究活动的基础,也是借助生物技术改良甜菜性状等各种应用研究的前提条件。我国甜菜基因资源目前还相当缺乏,基因克隆工作处于起步阶段。现阶段而言,获得充... 详细信息

甜菜(Beta vulgaris L.)是我国重要的糖料作物,甜菜基因资源是开展一切分子机制研究活动的基础,也是借助生物技术改良甜菜性状等各种应用研究的前提条件。我国甜菜基因资源目前还相当缺乏,基因克隆工作处于起步阶段。现阶段而言,获得充足的基因资源仍然是甜菜生物技术研究的一项重点任务。本论文以课题组前期获得的一个与甜菜二年生性状相关的ssr分子标记位点Bv RE049为起始材料,通过电子克隆获得标记位点及其相关基因。首先利用自建的转录本数据库结合公共数据库对标记位点进行电子延伸;然后通过生物学实验,验证并克隆所得片段,获得目的片段的确切序列;重复以上过程直至获得标记位点所在区域的完整基因位点;最后对该基因位点的结构、序列特征和编码产物特征进行分析与预测。通过本研究,将加深对甜菜标记位点Bv RE049及其相关性状的认识,为甜菜生物技术研究提供新的基因资源与注释信息,为此后对该标记、基因、性状的深入研究打下基础。主要研究结果如下:(1)通过对标记位点的电子延伸,得到了一条3000bp左右的序列,位于甜菜基因组2号染色体上,有可能位于基因编码区。(2)对电子延伸结果通过生物学实验进行了克隆和验证。通过PCR扩增、回收,连接,转化,测序等,最终获得了基因位点的序列全长,总长度为3005bp。该基因在序列上与菠菜和藜麦中的PCNA-like基因的相似性较高,将基因命名为Bv PCNA-like,(3)对所得基因位点进行了生物信息学分析。在核苷酸水平上,确定了基因位点位于2号染色体,并预测出了其中包含一个长1218个碱基的ORF,编码405个氨基酸;在氨基酸水平上,推断出该基因编码蛋白没有明显的跨膜区,不属于膜结合蛋白,可能是亲水性蛋白,位于细胞核的几率相对较大,功能与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相关。(4)对基因位点的结构进行了分析,预测了基因结构,推断该基因位点可能由4段外显子组成,针对该结构设计了基因剪接位点的验证方案以及相应的引物。并且分析了基因上游的调控元件情况,预测出多种顺式作用元件。

关键词：甜菜标记位点电子克隆编码区结构调控元件

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可变剪接在糖料作物上的研究进展

中国糖料 2023年第3期45卷 21-26页

作者：徐悦申子萌王希赵春雷黑龙江大学现代农业与生态环境学院/中国农业科学院甜菜研究所哈尔滨150080 上海信致医药科技有限公司上海200000 陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳745000 黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江省甜菜工程技术研究中心哈尔滨150080 国家糖料改良中心/中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室哈尔滨150080 甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室甘肃庆阳745000 中资蓝天生态科技(北京)有限公司北京100083

可变剪接在真核生物中普遍存在,是生物体产生多种蛋白质的一个重要机制。大量证据表明,可变剪接的复杂性与植物的发育、进化、适应性有关。可变剪接的相关研究为培育优质的作物品种提供了理论依据。文章主要综述了可变剪接的类型、研究... 详细信息

可变剪接在真核生物中普遍存在,是生物体产生多种蛋白质的一个重要机制。大量证据表明,可变剪接的复杂性与植物的发育、进化、适应性有关。可变剪接的相关研究为培育优质的作物品种提供了理论依据。文章主要综述了可变剪接的类型、研究方法以及糖料作物关于可变剪接的最新研究进展,并结合当前的研究形势对未来可变剪接的研究方向提出建议。研究发现,甘蔗、甜菜、甜叶菊糖料作物的可变剪接研究几乎都处于尝试阶段,今后在分子机制、规律、功能等方面还有大量的未知信息有待研究,可变剪接的研究可为提高糖料作物抗逆性、环境适应性、产糖量等方面提供帮助。

关键词：糖料作物甜菜甘蔗甜叶菊可变剪接研究进展

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植物可变剪接研究进展

农学学报 2022年第8期12卷 22-26页

作者：徐悦王希申子萌黑龙江大学现代农业与生态环境学院/中国农业科学院甜菜研究所哈尔滨150080 黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江省甜菜工程技术研究中心哈尔滨150080 国家糖料改良中心/中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室哈尔滨150080 上海信致医药科技有限公司上海200000 中资蓝天生态科技(北京)有限公司北京100083

选择性剪接广泛存在于植物中,是生物体转录组和蛋白质组多样性的主要来源。随着科技的发展,可变剪接的研究方法逐渐变得简单方便高效,越来越多的可变剪接事件在植物中被发现。本研究对植物可变剪接的机制、研究方法以及几种植物的最新... 详细信息

选择性剪接广泛存在于植物中,是生物体转录组和蛋白质组多样性的主要来源。随着科技的发展,可变剪接的研究方法逐渐变得简单方便高效,越来越多的可变剪接事件在植物中被发现。本研究对植物可变剪接的机制、研究方法以及几种植物的最新可变剪接研究进展进行分析,并且对未来应深入研究的方向给出了建议。

关键词： mRNA 可变剪接植物拟南芥大豆单分子测序技术

甜菜基因BvPCNA-like的克隆及结构分析

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中国糖料 2023年第2期45卷 16-25页

作者：刘昕彤申子萌张琦张西宁陶艳昵李志烨王希赵春雷黑龙江大学现代农业与生态环境学院/中国农业科学院甜菜研究所哈尔滨150080 陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳745000 黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江省甜菜工程技术研究中心哈尔滨150080 国家糖料改良中心/中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室哈尔滨150080 甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室甘肃庆阳745000 中资蓝天生态科技(北京)有限公司北京100083

本文旨在利用分子标记位点克隆糖用甜菜(Beta vulgaris L.)中的BvPCNA-like基因的基因组位点及完整的编码区(Coding sequence,CDS),并对该CDS在基因组中的结构进行分析与验证,为进一步研究该基因的功能奠定基础。利用甜菜EST-ssr标记BvR... 详细信息

本文旨在利用分子标记位点克隆糖用甜菜(Beta vulgaris L.)中的BvPCNA-like基因的基因组位点及完整的编码区(Coding sequence,CDS),并对该CDS在基因组中的结构进行分析与验证,为进一步研究该基因的功能奠定基础。利用甜菜EST-ssr标记BvRE049,以糖用甜菜种质‘DP02’(标记检测阳性)为材料,通过电子克隆策略获得标记相关基因的基因组位点,进而克隆基因CDS片段;预测CDS在基因组中的外显子和内含子个数及内含子剪接位点分布范围,并设计PCR引物组合对以上结构进行验证;同时用在线生物信息学分析软件分析该基因产物的基本特征。克隆获得了甜菜基因BvPCNA-like的编码区,全长1164 bp,编码产物含387个氨基酸,分子量约42736.25 Da,等电点约4.46,在基因组中,该基因由3个内含子分隔成4个外显子。本研究克隆了BvPCNA-like基因的完整编码区,预测并验证了其在基因组位点中的结构,为进一步深入研究BvPCNA-like基因在甜菜体内的功能奠定了基础。

关键词：甜菜增殖细胞核抗原基因克隆编码区结构生物信息学

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糖料作物启动子研究进展

中国糖料 2022年第2期44卷 22-27页

作者：孟帅辰王希陈丽黑龙江大学现代农业与生态环境学院/中国农业科学院甜菜研究所哈尔滨150080 黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江省甜菜工程技术研究中心哈尔滨150080 国家糖料改良中心/中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室哈尔滨150080

启动子是启动基因表达的关键因素。研究启动子的表达模式,对于理解靶基因的调控和时空表达特异性具有重要意义;建立快速、高效和可复制的启动子评价工具与遗传转化技术,对各种启动子与基因的功能分析至关重要;启动子克隆则更是构建基因... 详细信息

启动子是启动基因表达的关键因素。研究启动子的表达模式,对于理解靶基因的调控和时空表达特异性具有重要意义;建立快速、高效和可复制的启动子评价工具与遗传转化技术,对各种启动子与基因的功能分析至关重要;启动子克隆则更是构建基因工程载体,表达目的蛋白以及验证启动子自身功能的必要前提。文章综述了糖料作物关于启动子克隆与分析的最新研究进展,并结合当前的研究存在问题对未来启动子的研究方向提出建议。研究发现,甘蔗的启动子克隆与分析在分蘖、糖分代谢及非生物胁迫等方面已经取得了一定进展,甜菜、甜叶菊和甜高粱糖料作物的启动子研究也已经起步,但研究对象相对比较分散,研究也不够系统,此外,目前在启动子分子机制、结构、详细功能等方面则均有大量的未知信息有待研究。启动子研究的进展又依赖于序列信息与分子机制信息的丰富,因此糖料作物的启动子研究与基因资源及其调控机制的研究有必要互相支持、协同发展,且均需要数量更多、质量更高、信息更全面的序列信息作为支撑。随着分子生物学的快速发展,技术手段的不断创新、各种序列与注释信息的继续丰富,相信将会有更多糖料作物的启动子得到更深入的研究,并为基因调控机制等研究提供依据。

关键词：启动子糖料作物甘蔗甜菜甜高粱甜叶菊研究进展

植物增殖细胞核抗原与DNA复制关系的研究现状

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农学学报 2023年第1期13卷 66-72页

作者：刘昕彤王希黑龙江大学现代农业与生态环境学院/中国农业科学院甜菜研究所哈尔滨150080 黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江省甜菜工程技术研究中心哈尔滨150080 国家糖料改良中心/中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室哈尔滨150080

为了更深入的对植物增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)进行研究,本研究归纳了PCNA的研究现状,总结了PCNA的结构特征和包括PCNA参与DNA复制、DNA损伤修复和细胞周期调控等在内的PCNA的功能特点。目前有关PCNA的... 详细信息

为了更深入的对植物增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)进行研究,本研究归纳了PCNA的研究现状,总结了PCNA的结构特征和包括PCNA参与DNA复制、DNA损伤修复和细胞周期调控等在内的PCNA的功能特点。目前有关PCNA的研究以医学和动物体为主,有关植物PCNA研究的报道很少且相对落后,但已有文献指出,PCNA调控DNA复制,参与DNA复制以确保植物体正常生长发育,因此植物PCNA的功能值得继续研究。

关键词：增殖细胞核抗原细胞增殖 DNA复制 DNA修复细胞周期调控