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三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1 SYBR Green I荧光定量PcR检测方法的建立及初步应用

海洋与湖沼 2024年第5期55卷 1273-1281页

作者：赵丹阳施慧许文军何杰王庚申浙江省海洋水产研究所浙江舟山316021 浙江海洋大学水产学院浙江舟山316022

为建立十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1,DIV1)的SYBR GreenⅠ荧光定量PcR检测方法,根据DIV1的McP和ATPase基因序列,设计并筛选出引物,以制备的DIV1阳性质粒标准品为模板构建标准曲线,建立DIV1的SYBR Green I qPcR方法,并对... 详细信息

为建立十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1,DIV1)的SYBR GreenⅠ荧光定量PcR检测方法,根据DIV1的McP和ATPase基因序列,设计并筛选出引物,以制备的DIV1阳性质粒标准品为模板构建标准曲线,建立DIV1的SYBR Green I qPcR方法,并对该方法进行临床初步应用。结果显示,建立的qPcR方法阈值循环数(cycle threshold value,ct)与标准品拷贝数的对数线性关系良好,标准曲线相关系数(R^(2))为0.999;对DIV1阳性的虾蟹核酸样本能够进行特异性扩增,但对传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)和白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)阳性核酸样本均无扩增;最低检测限为9.77 copies/μL;ct值的组内和组间变异系数均小于1%。运用该方法对70份疑似感染DIV1的虾蟹类样本进行DIV1检测,该方法阳性率为48.57%,与套式PcR检测方法的阳性率一致;利用建立的方法对DIV1阳性三疣梭子蟹的血淋巴、肝胰腺及心脏等组织进行定量检测分析,结果显示各组织中均存在DIV1,其中血淋巴中DIV1平均拷贝数最高。研究表明,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PcR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于对DIV1的快速、定量检测,对十足目虹彩病毒病的诊断和防控具有重要意义。

关键词：十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1,DIV1) 荧光定量PcR SYBR GreenⅠ 检测方法

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漂白粉消毒后对虾养殖源水细菌群落的响应特征研究

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海洋与湖沼 2024年第1期55卷 202-212页

作者：王庚申颜懿李彤董鹏生谢建军许文军张德民张化俊宁波大学农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室浙江宁波315211 宁波大学海洋学院浙江宁波315211 浙江省海洋水产研究所浙江省海水增养殖重点实验室浙江舟山316021

漂白粉消毒是凡纳滨对虾养殖源水常见的管控措施,可有效控制病原菌传播;然而,消毒会强烈扰动水体微生物群落,但源水细菌群落对漂白粉消毒的响应特征尚未阐明。在室内条件下,设置高浓度(60 mg/L)和低浓度(20 mg/L)漂白粉消毒源水,通过高... 详细信息

漂白粉消毒是凡纳滨对虾养殖源水常见的管控措施,可有效控制病原菌传播;然而,消毒会强烈扰动水体微生物群落,但源水细菌群落对漂白粉消毒的响应特征尚未阐明。在室内条件下,设置高浓度(60 mg/L)和低浓度(20 mg/L)漂白粉消毒源水,通过高通量测序及荧光定量PcR技术探究消毒后源水细菌群落、病原菌及抗生素抗性基因(ARGs)的动态响应规律。结果显示,消毒后,拟杆菌门(Bacteroidota)丰度上升,高浓度组变形菌门(Proteobacteria)的丰度显著降低;至第3天,两组源水的细菌群落组成趋于一致。此外,漂白粉消毒显著改变了源水的细菌群落结构及共现网络的复杂性。在控制水体病原菌方面,消毒后病原菌的总丰度降低,但种类增加,高浓度漂白粉消毒对病原菌的抑制作用更加显著。漂白粉消毒对ARGs的去除具有选择性,仅对sul1、floR、cfr、tetQ有一定的去除作用,且高、低浓度对ARGs的去除无差异。综上,60 mg/L可以作为漂白粉消毒养殖源水的更好浓度选择。研究结果从微生物生态视角评价了不同浓度漂白粉的消毒作用,可为对虾养殖生产中的源水管控提供理论支撑。

关键词：漂白粉养殖源水细菌群落病原菌抗性基因

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养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1的检出及组织病理学分析

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中国水产科学 2023年第8期30卷 1042-1053页

作者：赵丹阳施慧许文军何杰王庚申浙江海洋大学水产学院浙江省海洋水产研究所浙江省海水增养殖重点实验室

为探究浙江省舟山市某养殖池塘中三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴发疾病的病因,应用组织病理学、分子生物学和荧光原位杂交等技术手段,对患病三疣梭子蟹组织进行检验。研究发现,患病三疣梭子蟹的临床症状主要表现为食欲下降,行... 详细信息

为探究浙江省舟山市某养殖池塘中三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴发疾病的病因,应用组织病理学、分子生物学和荧光原位杂交等技术手段,对患病三疣梭子蟹组织进行检验。研究发现,患病三疣梭子蟹的临床症状主要表现为食欲下降,行动迟缓,鳃水肿;光学显微镜下观察鳃及血淋巴液未发现寄生虫,肝胰腺等组织中也未分离到致病菌;采用PcR方法对病蟹进行血卵涡鞭虫(hematodinium)、白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、青蟹双顺反子病毒(mud crab discistrovirus-1,McDV-1)以及青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus,SSRV)蟹类常见病原PcR检测,结果均为阴性;病蟹的肝胰腺、心脏、鳃等组织的病理切片中可观察到明显的细胞病变和嗜酸性包涵体;超薄切片电镜观察显示:病蟹的肝胰腺、心脏和鳃组织中均存在六边形病毒颗粒,粒子直径150nm左右,与已报道的十足目虹彩病毒1 (decapoda iridescent virus 1,DIV1)形态特征相似。采用特异性套式PcR检测方法对患病蟹组织样品进行DIV1病原检测,所有样本均扩增出457 bp和129 bp大小的目的片段。进一步根据Gen Bank中DIV1的主要衣壳蛋白(major capsid protein,McP)表达基因和三磷酸腺苷酶(ATPase)表达基因序列设计特异性引物,均能从病蟹样品中扩增出预期大小的McP和ATPase基因开放阅读框(open reading frame,ORF)区全长。将扩增获得的McP和ATPase基因ORF区全长进行测序和同源序列比对分析,进化树分析结果表明其与十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)病毒的McP和ATPase基因序列自然聚为一支,判定导致此次三疣梭子蟹发病病原为DIV1。根据原位杂交探针设计原则,以DIV1的McP和ATPase基因的保守区域为靶位点分别设计探针,通过荧光原位杂交获得了病毒粒子在病蟹肝胰腺、心脏、肌肉和鳃组织的分布情况,与电镜切片观察和套式PcR检测结果相符。研究结果可为海水养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1病诊断与防控提供参考。

关键词：三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1 组织病理原位杂交

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