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RAPD在肺炎克雷伯菌及产酸克雷伯菌分型中的应用

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中华医院感染学杂志 2024年 2881-2886页

作者：向琳陈雨珊晏嘉徐令清田国宝钟兰兰鲁洋李林海广州中医药大学研究生院广州医科大学附属清远医院(清远市人民医院)检验科中山大学中山医学院

目的探索随机扩增多态DNA技术（RAPD）在肺炎克雷伯菌及产酸克雷伯菌分型中的应用。方法收集2022年12月—2023年10月清远市人民医院临床分离的产酸克雷伯菌22株、肺炎克雷伯菌74株,通过筛选模板、单引物、RAPD反应体系及扩增参数、双... 详细信息

目的探索随机扩增多态DNA技术（RAPD）在肺炎克雷伯菌及产酸克雷伯菌分型中的应用。方法收集2022年12月—2023年10月清远市人民医院临床分离的产酸克雷伯菌22株、肺炎克雷伯菌74株,通过筛选模板、单引物、RAPD反应体系及扩增参数、双引物,构建克雷伯菌分型体系,后进行聚合酶链反应（PCR）扩增仪器间、扩增批次内（间）重复性实验。对96株已知克雷伯菌确定分型相似度标准,运用NTsys 2.10软件构建遗传距离聚类图。结果煮沸提取基因组DNA满足实验需要,可在-20℃、60 d条件下稳定保存;筛选出7条单引物用于双引物配对组合,最佳双引物反应体系为:引物各1μ1,模板DNA 0.75μl,2×PCR Taq Mix 9μl,ddH2O8.25μl;最佳扩增参数为Tm=38℃,退火40 s,循环30次;重复性实验获得的RAPD图谱结果基本一致。分型效果最好的双引物组合为RAPD1+M13,该引物组合可在86%的相似度下区分肺炎克雷伯菌与产酸克雷伯菌的差异,将96株克雷伯菌分为40种亚型。结论上述双引物组合可初步用于RAPD对肺炎克雷伯菌及产酸克雷伯菌的种间分型,操作简便,具有较好重复性和稳定性,对病原微生物的分子流行病学分类具有重要意义。

关键词：随机扩增多态DNA技术肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌细菌分型技术

环磷酰胺不同剂量及停药周期构建小鼠卵巢早衰动物模型比较研究

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生殖医学杂志 2024年第3期33卷 365-372页

作者：莫金桦胡鸿颜秋霞李鹏东陈彩蓉广州医科大学附属清远医院(清远市人民医院)生殖医学中心清远511500 广州医科大学附属清远医院(清远市人民医院)中心实验室清远511500

目的比较环磷酰胺(CTX)不同剂量和停药周期构建的小鼠卵巢早衰(POF)动物模型,寻找最佳造模方式,为进一步研究POF提供更为适用的实验模型。方法8周龄动情周期规律的C57BL/6雌性小鼠共40只,随机分成5组:CON(对照组),CTX80(80 mg·kg^(-1)... 详细信息

目的比较环磷酰胺(CTX)不同剂量和停药周期构建的小鼠卵巢早衰(POF)动物模型,寻找最佳造模方式,为进一步研究POF提供更为适用的实验模型。方法8周龄动情周期规律的C57BL/6雌性小鼠共40只,随机分成5组:CON(对照组),CTX80(80 mg·kg^(-1)·d^(-1)),CTX100(100 mg·kg^(-1)·d^(-1)),CTX120(120 mg·kg^(-1)·d^(-1)),CTX150(150 mg·kg^(-1)·d^(-1)),连续腹腔注射10 d,CON组注射生理盐水,其余组注射不同剂量CTX。记录小鼠体重、动情周期和卵巢脏器系数等,比较得出CTX诱导POF模型最佳暴露剂量。使用最佳CTX暴露剂量重新造模,随机分为模型组和对照组,分别在停药后第1、2、3、4周,检测血清性激素,计数各级卵泡等,比较得出CTX诱导POF模型最佳停药周期。结果(1)研究最佳造模剂量时,CTX150死亡2只,而CTX80小鼠仍有完整的动情周期,说明这两种剂量并非最佳。CTX各组在暴露过程中体重呈进行性下降,停止暴露后体重开始回升,但至停药第7天各组体重仍显著低于CON组(P0.05)。考虑到尽量缩小药物对实验动物伤害的伦理要求,得出CTX诱导卵巢早衰模型的最佳暴露剂量为100 mg·kg^(-1)·d^(-1)×10 d。(2)研究最佳停药周期时,模型组停药后第1、2、3、4周血清抗苗勒管激素(AMH)水平、雌二醇(E_(2))水平、原始卵泡、初/次级卵泡均显著低于同期对照组(P<0.05),卵泡刺激素(FSH)水平在第1、3、4周均显著高于同期对照组(P<0.05),而第1、2、4周的闭锁卵泡计数均显著高于同期对照组(P<0.05),均表现出POF典型特征。随CTX停药周期延长,模型组小鼠原始卵泡、初/次级卵泡、成熟卵泡计数呈进行性下降,闭锁卵泡计数升高(P<0.05),CTX对卵巢功能损害呈进行性加重。比较得出CTX停药1周是诱导POF模型最佳成模周期。结论CTX100 mg·kg^(-1)·d^(-1)连续暴露10 d是建立CTX诱导小鼠POF模型的最佳造模剂量,最佳成模周期为停药后1周。

关键词：卵巢早衰动物模型环磷酰胺

D-柠檬烯对胶质母细胞瘤细胞增殖的抑制作用及其机制

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吉林大学学报（医学版） 2024年第3期50卷 647-657页

作者：王腾飞陈凤齐玲雷婷宋美慧大理大学药学院云南大理671000 广州医科大学附属清远医院广东省清远市人民医院广东清远511500

目的:探讨D-柠檬烯对胶质母细胞瘤(GBM)细胞增殖和凋亡的影响,并阐明其可能的作用机制。方法:将GBM细胞分为对照组(0 mmol·L^(-1)D-柠檬烯)和0.2、 0.4、 0.6、 0.8及1.0 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率... 详细信息

目的:探讨D-柠檬烯对胶质母细胞瘤(GBM)细胞增殖和凋亡的影响,并阐明其可能的作用机制。方法:将GBM细胞分为对照组(0 mmol·L^(-1)D-柠檬烯)和0.2、 0.4、 0.6、 0.8及1.0 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率,克隆形成法检测各组细胞克隆形成率,AnnexinⅤ-FITC/PI法检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中蛋白激酶B(AKT)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶(PARP)蛋白表达水平,免疫荧光法检测各组细胞中裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase)-3蛋白表达水平。15只建立皮下移植瘤模型小鼠随机分为空白组(0 mg·kg^(-1)·d^(-1) D-柠檬烯)、低剂量D-柠檬烯组(200 mg·kg^(-1)·d^(-1)D-柠檬烯)和高剂量D-柠檬烯组(400 mg·kg^(-1)·d^(-1)D-柠檬烯),每组5只。计算各组小鼠体内肿瘤抑制率,HE染色和免疫组织化学染色观察各组小鼠皮下肿瘤组织形态表现,并绘制肿瘤生长曲线,免疫组织化学法检测各组小鼠皮下瘤组织中Ki67蛋白阳性表达率,TUNEL染色法检测各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况。结果:对照组细胞呈长梭形,状态良好,紧密且贴壁生长,细胞器和细胞质正常;给药48 h后,0.6 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组细胞体积减小,细胞膜虽完整但通透性增强,细胞质皱缩,细胞内部产生空泡结构,部分呈碎片状漂浮在溶液表面;0.8和1.0 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组细胞中有明显凋亡小体生成,呈现凋亡状态。CCK-8法,与对照组比较,0.6、0.8和1.0 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组U87、 LN229及GL261细胞增殖抑制率均明显升高(P<0.01),0.4 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组U87和GL261细胞增殖抑制率均明显升高(P<0.01)。克隆形成法,与对照组比较,0.4、0.6和0.8 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组U87、LN229及GL261细胞克隆形成率均明显降低(P<0.05或P<0.01)。AnnexinⅤ-FITC/PI法,与对照组比较,D-柠檬烯处理48 h后,0.6、0.8和1.0 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组LN229细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。Western blotting法,与对照组比较,0.6、0.8和1.0 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组LN229细胞中Bax蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),AKT和Bcl-2蛋白表达水平均明显降低(P<0.01);0.8和1.0 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组LN229细胞中PARP蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。免疫荧光法,与对照组比较,0.6、0.8和1.0 mmol·L^(-1) D-柠檬烯组LN229细胞中cleaved Caspase-3蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。与空白组比较,低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤体积均明显减小(P<0.01)。与空白组比较,低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤质量均明显降低(P<0.05),肿瘤抑制率均明显升高(P<0.05)。空白组小鼠肿瘤细胞弥漫分布,细胞核染色加深,核浆比增大;低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤组织出现大量肿瘤细胞变性坏死。与空白组比较,低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤组织中Ki67蛋白阳性表达率均明显降低(P<0.01)。与空白组比较,低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤细胞凋亡率均明显升高(P<0.01)。结论:D-柠檬烯具有抑制GBM细胞增殖的作用,其作用机制可能与调控AKT蛋白的表达并激活Caspase-3通路诱导凋亡有关。

关键词： D-柠檬烯胶质母细胞瘤细胞凋亡移植瘤蛋白激酶B

导管相关血流感染金黄色葡萄球菌耐药性及其生物膜形成机制

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中华医院感染学杂志 2024年第6期34卷 826-831页

作者：邓欣王佳琳晏嘉向琳陈雨珊温伟洪汤英贤徐令清黄民中山大学药学院广东广州510006 广州医科大学附属第六医院药学部广东清远511518 广州医科大学附属第六医院检验医学部广东清远511518 中山大学临床药理研究所广东广州510080

目的探究临床分离导管相关血流感染金黄色葡萄球菌(SA)菌株的耐药性、生物膜形成能力和生物膜相关基因之间的关系。方法收集临床分离血液及导管标本42株SA,其中导管13株、非导管29株;采用结晶紫染色法分析生物膜形成能力;聚合酶链反应(P... 详细信息

目的探究临床分离导管相关血流感染金黄色葡萄球菌(SA)菌株的耐药性、生物膜形成能力和生物膜相关基因之间的关系。方法收集临床分离血液及导管标本42株SA,其中导管13株、非导管29株;采用结晶紫染色法分析生物膜形成能力;聚合酶链反应(PCR)检测多糖编码基因和毒力基因。结果42株SA中耐甲氧西林SA(MRSA)16株、甲氧西林敏感SA(MSSA)26株且导管组MSSA比例更高;强产膜株5株、弱产膜株20株、不产膜株17株,且导管组产膜率高于非导管组;icaA、icaD、icaBC、agr、sarA的表达率分别为69%、42.9%、4.8%、42.9%、85.7%且在导管组的表达高于非导管组;而毒力基因tsst、sea、pvl、hlg只在非导管组表达;毒力基因clf B、fnbA、fnbB、hla、hlb、hlg-2和黏附素基因在导管组的表达高于非导管组,肠毒素基因和中毒性休克综合征毒素基因反之。结论同属菌株在导管与非导管、耐药性、产膜能力方面均有相似性。导管内植物容易导致生物膜形成扩散,相关基因随之高表达。生物膜在导管相关菌株中形成能力较强,且产膜菌株耐药率高。多糖编码基因和黏附素基因可能正向调控生物膜形成,与导管呈正相关;肠毒素基因和中毒性休克综合征毒素基因为负调控因素。

关键词：导管相关血流感染金黄色葡萄球菌生物膜基因形成机制耐药性

多重PCR检测蜡样芽孢杆菌毒力基因方法学建立与初步应用

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中华医院感染学杂志 2024年第5期34卷 646-651页

作者：陈雨珊向琳晏嘉王娟徐淼玲刘加伟李齐光徐令清李林海广州中医药大学广东广州510006 清远市人民医院检验科广东清远500518

目的建立且优化一种能同时检测蜡样芽孢杆菌三种毒力基因的多重聚合酶链式反应(PCR)体系,初步应用于医院内环境中蜡样芽孢杆菌毒力基因检测。方法以蜡样芽孢杆菌的细胞毒素K(cytK)、肠毒素FM(entFM)、非溶血性肠毒素(nhe)三种毒力基... 详细信息

目的建立且优化一种能同时检测蜡样芽孢杆菌三种毒力基因的多重聚合酶链式反应(PCR)体系,初步应用于医院内环境中蜡样芽孢杆菌毒力基因检测。方法以蜡样芽孢杆菌的细胞毒素K(cytK)、肠毒素FM(entFM)、非溶血性肠毒素(nhe)三种毒力基因为靶基因,进行多重PCR,优化体系的引物浓度、退火温度、电泳时间和电压,验证该多重PCR体系灵敏度、特异性以及稳定性,并检测医院环境中蜡样芽孢杆菌毒力基因携带情况。结果成功建立多重PCR体系,nhe、cytK和entFM最佳引物浓度分别为8、20和6μm,退火温度为56℃,电泳条件为80V、30min。该体系灵敏度可达10^(-1)ng/μl,重复性好,特异性良好,可在-20℃稳定保存1个月。医院环境中蜡样芽孢杆菌毒力基因携带情况为:cytK基因携带率为75.00%,entFM基因携带率为66.67%,nhe基因携带率为16.67%。结论多重PCR可同时检测蜡样芽孢杆菌三种毒力基因,操作简便,重复性好,具有灵敏、特异、稳定的优点;医院环境中蜡样芽孢杆菌的毒力基因携带率高,提示应加强医院环境的清洁与消毒。此文为蜡样芽孢杆菌毒力基因的快速检测和芽孢感染的预防提供依据。

关键词：蜡样芽孢杆菌细胞毒素K 肠毒素FM 非溶血性肠毒素多重聚合酶链反应快速检测

基于深度学习构建金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的快速图像识别系统

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临床检验杂志 2024年第7期42卷 481-487页

作者：罗远美陈轲玮李振彰岳雨彪陈凌娟刘加伟李齐光李杨徐令清广州医科大学附属清远医院/清远市人民医院检验医学部广东清远511518 广州医科大学生物医学工程学院广州511436

目的基于GoogleNet、ResNet101和Vgg193种深度学习模型,对血流感染病原菌(金黄色葡萄球菌、粪肠球菌)进行高置信度的识别,比较模型间的性能与分类能力,探讨深度学习模型对血流感染病原菌快速识别的应用可行性。方法将革兰染色及摄像预... 详细信息

目的基于GoogleNet、ResNet101和Vgg193种深度学习模型,对血流感染病原菌(金黄色葡萄球菌、粪肠球菌)进行高置信度的识别,比较模型间的性能与分类能力,探讨深度学习模型对血流感染病原菌快速识别的应用可行性。方法将革兰染色及摄像预处理后的细菌图像和空白对照图像输入模型,进行训练与验证,共采集1682张金黄色葡萄球菌、1723张粪肠球菌和688张空白对照显微图像,对其中1344张金黄色葡萄球菌、1376张粪肠球菌和544张空白对照图像进行训练,余下的图像用于验证。根据模型间的分类参数评估出性能最佳的模型。结果ResNet101模型识别三类验证集图像的交叉熵损失值(0.0087103)最低,Epoch值(93)最大且准确率(99%)最高;GoogleNet模型识别三类验证集图像的交叉熵损失值为0.06389,Epoch值为86,准确率为98.6%;Vgg19模型识别三类验证集图像的交叉熵损失值为0.035682,Epoch值为86,准确率为97.7%。结论ResNet101模型在对三类验证集图像的分类上性能最佳;深度学习模型可对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的革兰染色图像进行准确、可信的快速识别。

关键词：深度学习革兰染色金黄色葡萄球菌粪肠球菌血流感染快速识别

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药机制及特征分析

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现代医院 2024年第1期24卷 144-148页

作者：王亚平麦吾丽旦·居来提张中文李玉珍徐令清温伟洪广州医科大学附属第六医院、清远市人民医院广东清远511518 广东医科大学广东东莞523000

目的探究本院耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbopenem-resistant pseudomonas aeruginosa,CRPA)的耐药机制及特征。方法用BD phoenix M50全自动鉴定药敏分析仪对菌株进行鉴定及药敏分析,微量肉汤稀释法测定头孢他啶/阿维巴坦的最低抑菌浓... 详细信息

目的探究本院耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbopenem-resistant pseudomonas aeruginosa,CRPA)的耐药机制及特征。方法用BD phoenix M50全自动鉴定药敏分析仪对菌株进行鉴定及药敏分析,微量肉汤稀释法测定头孢他啶/阿维巴坦的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),采用改良碳青霉烯类失活法(modified carbapenem inactivation method,mCIM)和胶体金免疫层析法对菌株进行碳青霉烯酶表型检测,采用全基因组测序对筛查阳性菌株进行碳青霉烯酶耐药基因检测及ST分型。结果①收集22株临床分离CRPA,其中耐药率最低的抗菌药物为头孢他啶/阿维巴坦(22.7%),然后依次为庆大霉素和阿米卡星(27.3%),哌拉西林/他唑巴坦(59.09%),头孢吡肟(63.6%),头孢他啶和氨曲南(77.27%),环丙沙星(86.36%),左氧氟沙星(95.45%)。②22株CRPA表型检测结果显示产碳青霉烯酶共5株(22.7%)。③全基因组测序结果显示,有4株ST549型CRPA携带金属β-内酰胺酶IMP-45及丝氨酸β-内酰胺酶OXA-1,OXA-50,1株为ST245型CRPA携带金属β-内酰胺酶NDM-1,即5株CRPA菌株均产金属β-内酰胺酶。结论产碳青霉烯酶不是本院CRPA对碳青霉烯耐药主要机制,CRPA对头孢他啶/阿维巴坦耐药率低且其耐药机制主要是产金属β-内酰胺酶。

关键词：铜绿假单胞菌碳青霉烯酶头孢他啶/阿维巴坦耐药特征

木质素抑制金黄色葡萄球菌所致皮肤感染的机制研究：生物膜形成核心基因筛选与验证

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基因组学与应用生物学 2024年

作者：黄树强谭翠钰陈淼琪袁晓珺李志宏陈婉茹李芝鸿张彤彤徐令清广州医科大学附属清远医院(清远市人民医院)检验科广州医科大学第三临床学院

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）生物膜形成常导致严重的皮肤感染。木质素是抑制SA生长的有效药物，分析木质素对SA生物膜形成的抑制作用和分子机制有助于为临床治疗皮肤感染提供指导。本研究通过结晶紫染色实验证实木质素... 详细信息

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）生物膜形成常导致严重的皮肤感染。木质素是抑制SA生长的有效药物，分析木质素对SA生物膜形成的抑制作用和分子机制有助于为临床治疗皮肤感染提供指导。本研究通过结晶紫染色实验证实木质素对SA生物膜的形成有抑制作用。随后，基于公共数据库获取木质素抑制SA生物膜形成的相关基因，结合机器学习与分子对接方法筛选核心基因。同时，设计人体皮肤SA生长密度预测模型，分析人体皮肤SA生长密度与生物膜形成相关基因表达水平的相关性。最后，通过实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）实验验证核心基因的表达水平。结果显示，木质素最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为16 mg/mL。随着木质素浓度升高，SA生物膜产量逐步减少。purA、trpB、hla、uhpT、leuC等核心基因拥有优越的与木质素结合的性能。人体皮肤预测模型显示，核心基因中trpB、leuC、leuD、dnaI与SA的皮肤生长密度评分呈负相关，而uhpT、hla、purA、dnaN与评分呈正相关。RT-qPCR结果表明，与未经处理的对照菌株相比，木质素处理后的菌株中hla、purA和uhpT基因的转录水平显著下降，而leuC和trpB基因的转录水平显著上升，与数据分析结果一致。本研究揭示了木质素对SA生物膜形成的靶向抑制作用，并阐明了其在SA皮肤感染中的治疗价值。

关键词：木质素金黄色葡萄球菌生物膜皮肤感染生物信息学

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癌变．畸变．突变 2024年第4期36卷 288-293,297页

作者：朱文标闫春梅丘波谢寿城肖焕钦刘高敏汕头大学医学院梅州临床学院/梅州市人民医院病理科广东梅州514031 嘉应学院医学院分子生物学中心实验室/病理教研室广东梅州514031 汕头大学医学院梅州临床学院/梅州市人民医院肝胆外科广东梅州514031

目的:探讨分泌型卷曲相关蛋白4(sFRP4)在肝细胞癌(HCC)中的表达及其与患者临床病理指标和预后的关系。方法:免疫组织化学法检测95例手术切除的HCC组织及癌旁组织中sFRP4蛋白的表达,分析sFRP4蛋白表达水平与患者临床病理指标及预后的关系... 详细信息

目的:探讨分泌型卷曲相关蛋白4(sFRP4)在肝细胞癌(HCC)中的表达及其与患者临床病理指标和预后的关系。方法:免疫组织化学法检测95例手术切除的HCC组织及癌旁组织中sFRP4蛋白的表达,分析sFRP4蛋白表达水平与患者临床病理指标及预后的关系,Cox比例风险回归模型分析影响HCC患者预后的因素。结果:sFRP4蛋白在HCC组织中的阳性表达率为48.42%(46/95),在癌旁组织中的阳性表达率为85.26%(81/95),sFRP4蛋白在HCC组织中的阳性表达率低于癌旁组织(χ^(2)=24.596;P<0.01)。sFRP4蛋白在不同组织学分级(χ^(2)=11.877,P<0.05)、组织学亚型(χ^(2)=3.873,P<0.05)及微血管侵犯(χ^(2)=6.493,P<0.05)的HCC组织中表达水平差异有统计学意义,s FRP4蛋白阴性组患者累积总生存期(OS)和累积无病生存期(PFS)显著短于阳性组(均为P<0.01)。多因素分析显示sFRP4蛋白表达水平[HR=0.238,95%CI(0.138,0.412),P<0.01]、中国肝癌临床分期[HR=2.438,95%CI(1.256,4.730),P<0.01]是影响HCC患者手术切除后PFS的独立风险因素,sFRP4蛋白表达水平[HR=0.226,95%CI(0.109,0.467),P<0.01]、组织学分级[HR=2.236,95%CI(1.199,4.170),P<0.05]是影响HCC患者手术切除后OS的独立风险因素。结论:sFRP4蛋白在HCC组织及癌旁组织中,以及不同病理特征的HCC组织中表达水平有差异,sFRP4蛋白阴性组患者预后较差,sFRP4蛋白表达水平是HCC患者手术切除后预后的独立风险因素。

关键词：肝细胞癌分泌型卷曲相关蛋白4 临床病理指标预后

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