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磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的制备及其鉴定

中国生物制品学杂志 2011年第7期24卷 835-838页

作者：王颖安宇李研东沈庆丰杜承柳增善罗云波黑龙江八一农垦大学食品学院食品科学教研室黑龙江大庆163319 吉林大学教育部人兽共患病重点实验室细菌室长春130062 黑龙江八一农垦大学生命科技学院黑龙江大庆163319 中国农业大学食品学院北京100083

目的制备磺胺二甲嘧(Sulfadimidine,SM2)啶单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法经小鼠腹腔免疫SM2-BSA抗原,采用常规技术进行细胞融合,间接竞争ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行亚克隆,硫酸铵-辛酸法纯化抗体,并鉴定其抗体效价... 详细信息

目的制备磺胺二甲嘧(Sulfadimidine,SM2)啶单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法经小鼠腹腔免疫SM2-BSA抗原,采用常规技术进行细胞融合,间接竞争ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行亚克隆,硫酸铵-辛酸法纯化抗体,并鉴定其抗体效价、杂交瘤细胞染色体数量、相对分子质量、抗体亚型、亲和力和特异性。结果筛选到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株3D7,细胞培养液上清和抗体效价分别为1∶6.4×102和1∶1.28×105;纯化后3D7抗体效价>1∶128 000,杂交瘤细胞染色体平均数为50±2对,分泌的抗体属于IgG1亚类,相对分子质量为164 280,亲和常数为6.09×108 M-1,与6种磺胺类药物及青霉素、庆大霉素和泰乐霉素交叉反应IC50大于1 mg/ml,交叉反应率小于0.01%。结论已成功制备了SM2单克隆抗体,该抗体能满足建立免疫学检测方法的需要。

关键词：磺胺二甲嘧啶抗体单克隆

弧菌三联融合毒素基因表达及ELISA检测方法建立

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中国生物工程杂志 2009年第11期29卷 74-81页

作者：李月婷卢士英周玉饶星霍方珍任洪林柳增善人兽共患病研究教育部重点实验室/吉林大学人兽共患病研究所/中国医学科学院病原生物学研究所人兽共患病研究中心长春130062

采用柔性Linker(GGGGS)和重叠延伸PCR方法将三个毒素基因,即副溶血性弧菌的耐热型直接溶血素基因tdh、创伤弧菌的溶细胞毒素基因vvhA和拟态弧菌的热不稳定型溶血素基因vmhA的成熟蛋白基因片段进行串联,得到三联融合毒素基因tdh-vvhA-vm... 详细信息

采用柔性Linker(GGGGS)和重叠延伸PCR方法将三个毒素基因,即副溶血性弧菌的耐热型直接溶血素基因tdh、创伤弧菌的溶细胞毒素基因vvhA和拟态弧菌的热不稳定型溶血素基因vmhA的成熟蛋白基因片段进行串联,得到三联融合毒素基因tdh-vvhA-vmhA(命名为FT)。一致性比对分析与预计融合的基因序列一致性为99.6%。FT的开放阅读框架全长3225bp,编码1074个氨基酸残基,预测分子量为120.4kDa。将FT亚克隆至表达载体pET-22b(+)中,再转化至***21(DE3)中进行表达,经SDS-PAEG分析,融合蛋白分子量与预测的相符。终浓度为1mmol/L的IPTG,37℃诱导4h,融合毒素蛋白表达量最高,经薄层扫描分析,此时融合毒素蛋白占全菌体蛋白的11.49%。融合毒素蛋白包涵体经纯化,免疫豚鼠制备血清抗体,确定间接ELISA的最佳工作条件,并进行敏感性、特异性、重复性及模拟样品检测试验,建立了食物中毒性弧菌广谱、快速、特异的同步免疫学检测方法。

关键词：食物中毒弧菌融合毒素 ELISA

副溶血性弧菌融合鞭毛基因的表达与免疫学性质

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中国兽医学报 2008年第4期28卷 394-398页

作者：李涛柳增善魏艳华王颖杜承卢士英张国才吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 吉林大学教育部人兽共患病重点实验室吉林长春130062 吉林省牧业管理局吉林长春130051

采用柔性Linker序列(Gly4Ser)对目的基因进行串联(FlaA-FlaF-FlaB),构建重组表达质粒pET-22b(+)-F3并在***21中进行表达,将表达蛋白纯化后免疫獭兔制备血清抗体,利用ELISA和琼脂扩散试验验证抗体的特异性与敏感性。结果显示,成功构建了... 详细信息

采用柔性Linker序列(Gly4Ser)对目的基因进行串联(FlaA-FlaF-FlaB),构建重组表达质粒pET-22b(+)-F3并在***21中进行表达,将表达蛋白纯化后免疫獭兔制备血清抗体,利用ELISA和琼脂扩散试验验证抗体的特异性与敏感性。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-F3并在***21中得到表达,表达蛋白主要以包涵体形式存在(表达量23.5%),基因序列全长3420bp,编码1140个氨基酸,蛋白相对分子质量为119000,测序结果与设计序列一致性为99%。ELISA和琼脂扩散试验表明,融合鞭毛F3与其他几种中毒性弧菌鞭毛具有一定的免疫交叉性,与多种非目标菌不发生反应。从而表明,多联融合鞭毛基因的表达质粒已构建成功并制备了抗血清,为利用融合鞭毛的方法检测食物中毒性弧菌,进而建立食物中毒性弧菌广谱、快速的检测方法奠定了基础。

关键词：副溶血性弧菌多联融合鞭毛表达免疫特性

抗盐酸克伦特罗单链抗体基因的克隆、序列分析及表达

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中国兽医学报 2007年第6期27卷 882-886页

作者：霍方珍卢士英周玉杨正涛柳增善吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 吉林大学教育部人兽共患病重点实验室吉林长春130062

提取分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,用一段柔性肽链-(G4S)3将VH和VL连接成ScFv。测序后经NCBI Blast分析,所得ScFv具有重组功能性鼠抗体可变区基因的特征。将所得目的基因与pET-22b(+)连... 详细信息

提取分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,用一段柔性肽链-(G4S)3将VH和VL连接成ScFv。测序后经NCBI Blast分析,所得ScFv具有重组功能性鼠抗体可变区基因的特征。将所得目的基因与pET-22b(+)连接,转化*** BL21,用IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析,37℃培养5 h表达量较大,25℃诱导表达以可溶性为主。

关键词：盐酸克伦特罗单链抗体序列分析表达

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海洋毒素大田软海绵酸完全抗原的制备与分析

海洋科学 2009年第2期33卷 46-49,54页

作者：卢士英周玉任洪林霍方珍潘风光柳增善于师宇于光人兽共患病教育部重点实验室吉林大学人兽共患病研究所吉林长春130062 福清出入境检验检疫局福建福清350300 吉林出入境检验检疫局吉林长春130062

为了建立大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)的免疫学检测方法,利用活泼酯法将OA分子中的羧基与载体蛋白上的氨基偶联,人工制备OA的免疫抗原(OA-IgG)和检测抗原(OA-BSA),经电泳、动物实验及ELISA法进行了鉴定,完全抗原的偶联成功,为利用杂... 详细信息

为了建立大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)的免疫学检测方法,利用活泼酯法将OA分子中的羧基与载体蛋白上的氨基偶联,人工制备OA的免疫抗原(OA-IgG)和检测抗原(OA-BSA),经电泳、动物实验及ELISA法进行了鉴定,完全抗原的偶联成功,为利用杂交瘤技术制备OA的单克隆抗体和海产品OA免疫学检测方法奠定了良好的基础。

关键词：大田软海绵酸(okadaic acid OA) 活泼酯法抗原偶联

抗河豚毒素单链抗体基因的构建、表达及活性分析

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中国卫生检验杂志 2009年第1期19卷 14-16,178页

作者：孟宪梅周玉卢士英李岩松张俊辉李研东张磊柳增善吉林大学人兽共患病教育部重点实验室畜牧兽医学院长春130062 吉林工商学院生物工程分院长春130062

目的:构建抗河豚毒素(TTX)单链抗体表达载体并进行活性分析。方法:提取抗TTX单克隆抗体3D4杂交瘤细胞总RNA,根据鼠源单克隆抗体设计轻、重链可变区基因VL和VH引物并进行RT-PCR扩增,借助Linker(G1y4Ser)3连接成单链抗体TTX-ScFv(VH-Linke... 详细信息

目的:构建抗河豚毒素(TTX)单链抗体表达载体并进行活性分析。方法:提取抗TTX单克隆抗体3D4杂交瘤细胞总RNA,根据鼠源单克隆抗体设计轻、重链可变区基因VL和VH引物并进行RT-PCR扩增,借助Linker(G1y4Ser)3连接成单链抗体TTX-ScFv(VH-Linker-VL)基因,克隆至表达载体pET-22b(+)后转入***21(DE3)诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA检测表达蛋白的反应活性。结果:测序结果表明TTX-ScFv基因全长744 bp,经NCBI blast分析氨基酸序列符合鼠抗体可变区特征,其中VH366 bp,VL333 bp,Linker 45 bp,SDS-PAGE与薄层扫描分析显示表达产物相对分子量为26.045ku,表达蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总量的42%;ELISA检测表明TTX-ScFv可与TTX特异结合。结论:成功构建了抗TTX单链抗体表达载体,表达产物具有一定的免疫学结合活性。

关键词：河豚毒素单链抗体表达活性

HEPES和NaHCO3对RPMI-1640培养液的渗透压和pH值的影响

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化学工程与装备 2008年第9期 40-43页

作者：李岩松柳增善周玉人兽共患病教育部重点实验室吉林大学军需科技学院

本文对实验室利用RPMI-1640干粉配制培养液时易忽视的渗透压和pH值等因素进行了比较分析,提出配制培养液时对渗透压和pH值控制的关键因素。

关键词： RPMI1640 培养液渗透压 pH值

食源性致病菌六联融合毒素的构建及免疫学特性研究

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同方期刊数据库

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现代预防医学 2009年第6期36卷 1122-1126页

作者：宫彬彬柳增善于师宇孟宪梅卢士英任洪林李兆辉王克坚吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病教育部重点实验室近海海洋环境科学国家重点实验室厦门大学海洋与环境学院

[目的]构建4种食源性致病菌融合毒素基因及重组表达载体,制备六联融合毒素的血清抗体。[方法]采用柔性Linker序列(G-G-G-G-S)对目的基因进行串联(HblA-VT1B-SEA-VT2B-BoNTaHc-SEB),构建重组表达质粒pET-22b(+)-F6并在*** BL21中进行表达... 详细信息

[目的]构建4种食源性致病菌融合毒素基因及重组表达载体,制备六联融合毒素的血清抗体。[方法]采用柔性Linker序列(G-G-G-G-S)对目的基因进行串联(HblA-VT1B-SEA-VT2B-BoNTaHc-SEB),构建重组表达质粒pET-22b(+)-F6并在*** BL21中进行表达,将表达蛋白纯化后免疫豚鼠制备血清抗体,利用ELISA和琼脂扩散试验验证抗体的特异性与敏感性。[结果]成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-F6并在*** BL21中成功表达,37℃表达蛋白主要以包涵体形式存在(表达量10.2%),基因序列全长3384bp,编码1127个氨基酸,蛋白分子量为127205,测序结果与设计序列一致性为100%。ELISA和琼脂扩散试验表明,融合毒素F6与4种食源性致病菌有良好的反应原性,与多种非目标菌不反应。[结论]成功构建了多联融合毒素基因的表达质粒及制备了抗血清,为利用融合毒素的方法检测食源性致病菌,进而建立食源性致病菌广谱、快速的检测方法奠定基础。

关键词：食源性致病菌基因串联融合毒素血清抗体 ELISA检测