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基于RNAi技术的中华豆芫菁HMGR基因与斑蝥素生物合成关系的研究

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基于RNAi技术的中华豆芫菁HMGR基因与斑蝥素生物合成关系的研究

作者：霍棠西北农林科技大学

学位级别：硕士

斑蝥素(Cantharidin,C10H12O4)是以鞘翅目(Coleopera)芫菁科(Meloidae)昆虫为主产生的一种萜类毒素,因其对生物体内部分生物活性能产生抑制作用而在医药和植保领域受到高度重视,具有极高的利用价值,但斑蝥素的生产是其应用的瓶颈,因此,... 详细信息

斑蝥素(Cantharidin,C10H12O4)是以鞘翅目(Coleopera)芫菁科(Meloidae)昆虫为主产生的一种萜类毒素,因其对生物体内部分生物活性能产生抑制作用而在医药和植保领域受到高度重视,具有极高的利用价值,但斑蝥素的生产是其应用的瓶颈,因此,明确斑蝥素在芫菁体内的生物合成途径对其资源开发具有极为重要的意义。大量研究证实,昆虫萜类物质生物合成途径是甲羟戊酸(Mevalonic acid,MVA)途径,而且3-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroy-3-methyl-glutary-CoA,HMGR)是其关键限速酶。本研究以中华豆芫菁Epicauta chinensis为研究对象,通过体外合成靶基因HMGR的dsRNA,用注射法将dsRNA导入虫体进行干扰,并使用相对实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测干扰后HMGR mRNA的表达水平,同时使用气相色谱(Gas chromatography,GC)内标法检测同一试虫的斑蝥素含量。分析HMGR mRNA被成功干扰后对芫菁体内斑蝥素合成的影响,推断HMGR基因与斑蝥素生物合成的关系。为了选择可靠的相对实时定量内参基因,本研究采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cDNA序列,并使用生物信息学软件进行序列分析;采用real-time PCR检测β-actin在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种组织以及注射刺激和非刺激条件下mRNA的表达量,进而验证β-actin基因在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。主要研究结果如下:1.克隆得到中华豆芫菁β-actin基因全长1673 bp,其中5’非编码区88 bp,3’非编码区455 bp,编码376个氨基酸,推测的蛋白分子量约为41.81 ku,理论等电点为5.09,该氨基酸序列与其他昆虫β-actin序列一致性可达97%～99%;Real-time PCR结果显示,β-actin mRNA在中华豆芫菁不同组织及注射刺激与非刺激条件下表达量无显著差异。说明该基因可作为中华豆芫菁试虫相对实时定量PCR研究中的可靠内参基因。该基因全长cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。2.测得中华豆芫菁雄虫交尾后0、1、2、3、4、5和7 d体内斑蝥素含量的变化及HMGR mRNA的相对表达量,结果显示刚结束交尾时雄虫体内斑蝥素含量很低,随时间变化呈现不断上升的趋势,因此可以确定雄虫在交尾结束后合成了斑蝥素;而且在斑蝥素含量上升的过程中有两个高峰期,即从交尾结束至第3天和从第5天到第7天。此外,real-time PCR结果显示HMGR mRNA在雄虫交尾后的表达量与斑蝥素含量随时间变化的趋势一致,均在刚结束交尾后有一个持续大量表达的过程,相关性分析发现二者存在着极显著的正相关关系(r=0.891)。这为后续的干扰实验奠定了基础,并将干扰的注射时间确定为结束交尾第0天的时刻。3.采用显微注射RNAi方法干扰中华豆芫菁体内HMGR mRNA的表达,结果发现在干扰后第2天,处理组(注射HMGR dsRNA)与对照组(注射GFP dsRNA、RNase-free H2O和空白对照)相比,HMGR mRNA表达量明显降低,仅为对照的10%左右,并一直持续于低水平,而对照组HMGR mRNA的表达量随时间变化逐渐增高,到第7天处理组的表达量不足对照组的5%。统计分析表明各个时间段处理组和对照组之间差异极显著,而三个对照组之间差异极不显著。说明注射HMGR dsRNA成功干扰了 HMGR mRNA的表达。同时检测同一试虫的斑蝥素含量,统计分析表明,干扰后前3天注射HMGRdsRNA的处理组与3组对照组之间没有显著性差异;从第5天开始,对照组斑蝥素含量持续上升,而处理组斑蝥素的合成受到了明显的抑制,含量约为对照的30%,到第7天斑蝥素含量不足对照的25%,与对照组差异显著。而各个时间段3个对照组之间无显著性差异。说明通过注射HMGR dsRNA成功干扰芫菁体内HMGR mRNA的表达后,芫菁体内斑蝥素的合成明显受到了抑制。本研究首次基于RNAi方法研究芫菁体内HMGR基因与斑蝥素合成的关系,成功建立了一套在芫菁体内进行RNAi研究的技术体系。实验结果表明,通过注射RNAi方法成功干扰了芫菁体内HMGR mRNA的表达,并在干扰后导致斑蝥素合成明显受阻。而HMGR是MVA途径的关键限速酶,因此可推测芫菁体内斑蝥素的生物合成可能通过MVA途径。研究结果为芫菁科昆虫体内斑蝥素生物合成途径的进一步探索奠定了基础。

关键词：中华豆芫菁斑蝥素生物合成 MVA途径 HMGR基因 β-actin基因

中华豆芫菁HMGR基因克隆及斑蝥素生物合成途径初探

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中华豆芫菁HMGR基因克隆及斑蝥素生物合成途径初探

作者：姜鸣西北农林科技大学

学位级别：硕士

斑蝥素(cantharidin,C10H12O4)是一种广泛存在于芫菁科及部分拟天牛科和蜡蝉科昆虫体内的萜类防御性毒素,不仅具有重要的医学价值,同时也具有很强的杀虫作用及抑菌、除草活性,在农业领域具有极大的潜在应用价值。由于原料缺乏而致斑蝥... 详细信息

斑蝥素(cantharidin,C10H12O4)是一种广泛存在于芫菁科及部分拟天牛科和蜡蝉科昆虫体内的萜类防御性毒素,不仅具有重要的医学价值,同时也具有很强的杀虫作用及抑菌、除草活性,在农业领域具有极大的潜在应用价值。由于原料缺乏而致斑蝥素无法进行大规模生产,这一直是限制其应用的一大障碍。为了从生物合成方面解决斑蝥素生产原料问题,本研究以中华豆芫菁Epicauta chinensis Laporte为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了甲羟戊酸途径的关键限速酶——3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)基因,并对该基因及其编码的蛋白进行了生物信息学分析;同时通过向虫体内注射该酶的抑制剂康帕丁及基因表达激活剂保幼激素Ⅲ,观察注射后对虫体斑蝥素含量的影响,以此来推断斑蝥素在芫菁体内的合成是否与甲羟戊酸途径有关。主要研究结果如下:1.克隆得到了中华豆芫菁Epicauta chinensis Laporte HMGR基因全长cDNA序列共3167 bp,包含一个2595 bp的开放阅读框,共编码864个氨基酸,5’非编码区228 bp,3’非编码区344bp,其与辣根猿叶虫Phaedon cochleariae的HMGR cDNA序列一致性可达74%,与其他昆虫的HMGR cDNA序列一致性达60%以上,可初步判定克隆所得为中华豆芫菁HMGR基因,上传至GeneBank获得序列号为JX096638。2.生物信息学分析发现,中华豆芫菁HMGR蛋白预测的理论分子量为95.1 kDa,等电点pI=6.11,预测分子式为C4234H6765N1127O1247S53,不稳定系数为45.59,故推测此蛋白为不稳定蛋白,存在7个跨膜区,属于跨膜蛋白,有2个O-糖基化位点,4个N-糖基化位点和2个O-GlcNAc糖基化位点,不存在信号肽结构,可推测该蛋白是锚定于膜上起作用的非分泌型糖蛋白。二级结构预测中无规则卷曲占42.94%,α-螺旋占37.38%,延伸链占19.68%,三维结构在空间上折叠成“V”字形,包含N-结构域、S-结构域和L-结构域三个结构域,其中L-结构域包含两个HMG-CoA结合基序和一个NADP(H)结合基序,S-结构域含一个NADP(H)结合基序。氨基酸序列同源性比对与辣根猿叶虫Phaedon cochleariae的相似度达到74.5%,与鳞翅目昆虫的相似度为46%～48%。3.康帕丁(1.6mM)注射实验结果显示,实验组其斑蝥素的平均含量为1.01%,对照组的平均含量为2.11%,统计学分析发现两者具有极显著差异(P性差异(P性,得出斑蝥素在芫菁体内的合成与甲羟戊酸途径有关,并通过荧光实时定量RT-PCR的方法检测得到,HMGR基因的表达量与斑蝥素在芫菁体内的生物合成量具有一定相关性。

关键词：斑蝥素克隆生物信息学甲羟戊酸途径保幼激素Ⅲ 康帕丁

一株银杏内生真菌的鉴定及其活性代谢产物研究

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中国生物防治学报 2012年第2期28卷 226-234页

作者：王国平王丽薇张亚磊王佳莹徐旭辉章初龙浙江大化浙大生物药物研发中心杭州310058 浙江大学生物技术研究所杭州310058 杭州师范大学医药卫生管理学院杭州310036 浙江工业大学药学院杭州310029 浙江大学农药与环境毒理研究所杭州310029

药用植物内生真菌是一类重要的微生物资源,能代谢产生多种生物活性物质,本研究从浙江天目山自然保护区银杏Ginkgo biloba中分离获得1株活性菌株TMSF169。通过形态学和ITS rDNA序列分析,鉴定该菌株为团青霉Penicillium commune。发酵粗... 详细信息

药用植物内生真菌是一类重要的微生物资源,能代谢产生多种生物活性物质,本研究从浙江天目山自然保护区银杏Ginkgo biloba中分离获得1株活性菌株TMSF169。通过形态学和ITS rDNA序列分析,鉴定该菌株为团青霉Penicillium commune。发酵粗提物采用正相硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析,以紫外光或碘蒸汽显迹,配合活性追踪,从菌株TMSF169发酵液中分离获得1个具抗真菌及除草活性的化合物TMSF169A,通过质谱和核磁共振波谱等技术将其结构鉴定为圆弧菌醛酸(cyclopaldic acid)。活性测试表明,该化合物具有抗菌活性,对鸭跖草Commelina communis,反枝苋Amaranthus retroflexus,马唐Digitaria sanguinalis、空心莲子草Alternanthera philoxeroides、水稻Oryza sativa等植物均具有致病毒性,对芝麻Sesamum indicum和大豆Glycine max不敏感。结果显示菌株TMSF169具有较好的开发应用价值。

关键词：内生真菌团青霉活性代谢产物除草活性圆弧菌醛酸

中华豆芫菁β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2012年第11期40卷 97-102,111页

作者：霍棠姜鸣吕淑敏张雅林西北农林科技大学植保资源与病虫害防治教育部重点实验室陕西杨凌712100

【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其... 详细信息

【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其进行序列分析;并用实时定量PCR方法检测在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种不同组织中及注射刺激和非刺激条件下β-actin基因的表达量。【结果】中华豆芫菁β-actin基因全长1 673bp,其中5′非编码区88bp,3′非编码区455bp,开放阅读框为1 120bp,编码376个氨基酸,推测其编码蛋白分子质量约为93.6ku,理论等电点为5.09,富含6类特定功能位点,其氨基酸序列与其他昆虫的β-actin序列一致性可达97%～99%;实时定量PCR结果显示,该基因在中华豆芫菁不同组织、注射刺激与非刺激情况下表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】中华豆芫菁β-actin基因可作为基因表达定量研究中的可靠内参。该基因的cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。

关键词：中华豆芫菁 β-actin基因反转录PCR RACE技术实时定量PCR

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除草剂室内高通量筛选方法研究

湖北农业科学 2011年第24期50卷 5119-5122页

作者：张志刚杨自文王开梅张亚妮张遵霞湖北省生物农药工程研究中心湖北省农业科技创新中心生物农药分中心武汉430064

以狗牙根为材料,对除草剂筛选的限制因素进行了研究。结果表明,水分流失和真菌污染是引起筛选结果不稳定的主要因素;运用多种规格的组织培养板和雾化补水可以控制水分流失对筛选的不利影响;添加抗真菌剂和对种子进行杀菌处理可以消除真... 详细信息

以狗牙根为材料,对除草剂筛选的限制因素进行了研究。结果表明,水分流失和真菌污染是引起筛选结果不稳定的主要因素;运用多种规格的组织培养板和雾化补水可以控制水分流失对筛选的不利影响;添加抗真菌剂和对种子进行杀菌处理可以消除真菌污染对靶标的侵害和延长试验的可观察时间。进一步的筛选试验结果表明,运用以上方法能够稳定、高效地对不同来源的样品进行筛选。

关键词：高通量筛选除草活性种子处理抗真菌剂

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34种植物丙酮提取物抑菌活性的初步筛选

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2012年第9期40卷 72-76,82页

作者：于志同韩立荣吴华冯俊涛张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心/陕西省生物农药工程技术研究中心陕西杨凌712100 西北农林科技大学植保资源与病虫害治理教育部重点实验室陕西杨凌712100

【目的】研究34种植物丙酮提取物的抑菌活性,为开发植物源杀菌剂提供线索和依据。【方法】采用生长速率法和活体组织法,测定了采自内蒙古、宁夏草原和荒漠地区34种植物丙酮提取物的抑菌活性。【结果】在0.1g/mL质量浓度下,白沙蒿、黑沙... 详细信息

【目的】研究34种植物丙酮提取物的抑菌活性,为开发植物源杀菌剂提供线索和依据。【方法】采用生长速率法和活体组织法,测定了采自内蒙古、宁夏草原和荒漠地区34种植物丙酮提取物的抑菌活性。【结果】在0.1g/mL质量浓度下,白沙蒿、黑沙蒿、蓼子朴、地肤、中间锦鸡儿、黄芪、甘草、骆驼蓬、圆叶盐爪爪、雾冰藜、滨藜和大麻12个植物样品丙酮提取物对黄瓜炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌中的至少一种病原菌的抑制率大于70%;蓼子朴、黑沙蒿、柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿、矮葱、乳浆大戟、沙打旺、甘草、虎尾草、猪毛菜和角蒿11种植物样品丙酮提取物对番茄灰霉病的保护作用大于75%;而碱蓬对番茄灰霉病菌菌丝生长则有明显的促进作用,促进效果为55.56%。【结论】黑沙蒿、蓼子朴、中间锦鸡儿和甘草的抑菌活性值得进一步研究。

关键词：抑菌活性番茄灰霉病菌黑沙蒿活性筛选植物源杀菌剂

微量元素对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响

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林业科学 2014年第2期50卷 134-138页

作者：李琰温鹏飞崔蕾雷嘉敏张兴西北农林科技大学生命科学学院杨凌712100 西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心杨凌712100

雷公藤（Tripterygium wilfordii）不仅是一种药用植物，还是一种有毒植物，在民间作为杀虫植物，有“菜虫药”之称，其主要活性成分雷公藤生物碱和雷公藤甲素既有杀虫活性又有医用活性（李琰等，2012；Brinker et al．，2005；Liu，201... 详细信息

雷公藤（Tripterygium wilfordii）不仅是一种药用植物，还是一种有毒植物，在民间作为杀虫植物，有“菜虫药”之称，其主要活性成分雷公藤生物碱和雷公藤甲素既有杀虫活性又有医用活性（李琰等，2012；Brinker et al．，2005；Liu，2011），临床上常用来治疗风湿性关节炎、肿瘤、免疫抑制性疾病（仲剑等，2009；Johnson et al．，2011；Huang et al．，2012）。

关键词：雷公藤不定根组织培养微量元素次生代谢产物

紫外(UV-B)及超声波处理对雷公藤悬浮细胞中三种次生代谢物含量的影响

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农业生物技术学报 2013年第9期21卷 1052-1059页

作者：祝传书冯明星缪国鹏冯俊涛张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心

目前已经找到一种由雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法,但是这种方法生产的次生代谢物产量较低,因此本研究利用紫外光(UV-B)辐照和超声波处理对雷公藤悬浮培养体系中萜类次生代谢物的含量... 详细信息

目前已经找到一种由雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法,但是这种方法生产的次生代谢物产量较低,因此本研究利用紫外光(UV-B)辐照和超声波处理对雷公藤悬浮培养体系中萜类次生代谢物的含量进行了检测分析。在雷公藤悬浮细胞的不同培养时期,利用不同时长的UV-B辐照和超声波分别处理的雷公藤悬浮细胞和培养体系,采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对悬浮细胞和培养液中雷公藤内酯醇、吉碱和次碱的含量进行测定。结果表明,利用UV-B辐照和超声波处理均可以显著提高雷公藤悬浮培养体系中悬浮细胞生长量及其次生代谢物的含量。紫外辐照及超声波处理均可使雷公藤悬浮细胞的生长量比对照提高1～2倍。在雷公藤悬浮细胞生长周期的第13天用UV-B辐照90 min,雷公藤悬浮细胞中内酯醇、吉碱和次碱产物含量达到最大,分别为5.185、39.747和42.189μg/L;超声波处理40 s时,次生代谢物含量达到最大,分别为5.185、40.080和45.472μg/L,与对照相比提高1～3倍。另外超声波处理对雷公藤悬浮细胞中次生代谢物释放分泌入细胞培养液中有一定程度的促进作用,通过对雷公藤悬浮细胞培养液中次生代谢物含量的检测发现,在处理时长分别为40 s时,内酯醇、吉碱和次碱的转化率分别达到93.7%、86.6%和88.1%,与对照相比含量提高1～3倍。本研究为解决雷公藤野生资源短缺,利用雷公藤悬浮细胞培养生产雷公藤内酯醇、吉碱和次碱提供基础资料。

关键词：雷公藤悬浮细胞培养紫外辐照超声波处理次生代谢物

伯氏嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus bovienii YL002对4种抗生素抗性突变株的筛选及抑菌活性分析

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中国生物防治学报 2012年第4期28卷 568-574页

作者：安欣王国红王永宏张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心/陕西省生物农药工程技术研究中心杨凌712100

为了提高伯氏嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus bovienii YL002抑菌活性,采用紫外线照射和吖啶橙复合诱变的方法,对其进行诱变改良,并在抗生素最小抑制浓度选择压力下筛选对4种抗生素具有抗性的突变菌株。以枯草芽孢杆菌为指示菌,得到了17株... 详细信息

为了提高伯氏嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus bovienii YL002抑菌活性,采用紫外线照射和吖啶橙复合诱变的方法,对其进行诱变改良,并在抗生素最小抑制浓度选择压力下筛选对4种抗生素具有抗性的突变菌株。以枯草芽孢杆菌为指示菌,得到了17株抑菌活性有显著变化且遗传稳定的突变菌株。其中菌株L0420-3对枯草芽孢杆菌的抑制活性最强,连续转接5次的抑菌圈直径增大率均在80%以上;菌株Q025-1和L0314-4对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制率为75.66%和73.41%,分别是野生菌株的1.35倍和1.31倍;接种灰霉病菌后5 d对番茄果实灰霉病的防效为95.74%和93.62%,分别是野生菌株的1.71倍和1.67倍。

关键词：昆虫病原线虫共生菌抗药性诱变菌种改良抑菌活性