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单链DNA退火蛋白介导细菌基因组同源重组的机制及应用研究进展

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生物技术通报 2024年

作者：尹号尤留超韩瑞高鹏程付磊储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具，而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一，传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题，而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白（SSAP）表现出了... 详细信息

基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具，而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一，传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题，而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白（SSAP）表现出了远超内源性重组途径的基因组编辑效率，该蛋白具有单链DNA结合活性、介导基因组定向重组的特点，使其成为目前极具潜力的基因组编辑工具。本文主要对同源重组基本原理、噬菌体源SSAP介导的同源重组途径的基本元件、重组机制模型以及应用策略展开概述，旨在为进一步解析单链DNA退火蛋白介导的同源重组过程提供帮助，为研究更多细菌基因功能、致病机制以及开发工程菌株提供技术支撑，也为缺乏基因编辑方法的细菌提供技术参考。

关键词：细菌单链DNA退火蛋白同源重组机制应用

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稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 43-48页

作者：杨雪任善会王相伟龚真莉殷相平孙跃峰陈豪泰万学瑞甘肃农业大学动物医学院兰州730046 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞... 详细信息

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。

关键词：绵羊睾丸原代细胞人端粒酶逆转录酶基因 hTERT 永生化细胞系

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GP35蛋白在牛支原体中互作分子的挖掘

中国兽医科学 2024年

作者：尹号尤留超黄蓉韩瑞高鹏程支飞杰马轲付磊储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

通过在牛支原体中表达GP35蛋白，利用IP-MS筛选其在牛支原体中的互作分子，将互作分子及GP35蛋白进行原核表达后展开互作验证。结果表明，牛支原体中的IP-MS筛选到了SSB蛋白和RmuC蛋白，前者为参与DNA复制过程的重要蛋白，而后者与DNA... 详细信息

通过在牛支原体中表达GP35蛋白，利用IP-MS筛选其在牛支原体中的互作分子，将互作分子及GP35蛋白进行原核表达后展开互作验证。结果表明，牛支原体中的IP-MS筛选到了SSB蛋白和RmuC蛋白，前者为参与DNA复制过程的重要蛋白，而后者与DNA重组过程相关。完成对GP35、SSB和RmuC蛋白的原核表达后，通过pull-down确定了GP35蛋白与SSB蛋白和RmuC蛋白存在互作关系，结果将有助于解析GP35蛋白在牛支原体中介导重组的机制。

关键词：牛支原体 GP35重组酶互作分子同源重组

牛结节性皮肤病病毒ORF123基因缺失重组病毒的构建及增殖能力分析

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畜牧兽医学报 2024年第10期 4530-4541页

作者：王芳萍任善会郜晓虹杨雪李积雲王相伟殷相平孙跃峰陈豪泰万学瑞甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所青海省科学技术信息研究所

旨在通过缺失牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF123基因，分析其增殖能力，为LSDV ORF123功能研究奠定基础。本研究利用同源重组，以ORF123基因作为靶标，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记，采用融合PCR方法，扩增同源左右臂序列以及EGFP... 详细信息

旨在通过缺失牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF123基因，分析其增殖能力，为LSDV ORF123功能研究奠定基础。本研究利用同源重组，以ORF123基因作为靶标，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记，采用融合PCR方法，扩增同源左右臂序列以及EGFP基因表达框，克隆至pUC-19T载体，构建基因缺失转移载体pH5-LSDVΔORF123-EGFP质粒。然后将pH5-LSDVΔORF123-EGFP质粒转染至Vero细胞，并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株，利用蚀斑、梯度稀释和挑取绿色荧光单克隆细胞筛选纯化重组毒株，并鉴定其遗传稳定性和增殖能力。结果显示，利用EGFP筛选标记，通过多次挑斑筛选纯化获得ORF123基因缺失的重组病毒株LSDVΔORF123-EGFP。该重组病毒至少在8代细胞传代中能稳定表达绿色荧光蛋白，接种MDBK细胞后绘制一步增殖曲线表明该重组病毒滴度略低于亲本毒株。本研究成功获得ORF123基因缺失的重组病毒株LSDVΔORF123-EGFP,为LSDV ORF123蛋白生物学功能研究以及减毒活疫苗的研制奠定基础。

关键词：牛结节性皮肤病病毒 ORF123基因增殖能力同源重组重组病毒

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应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株

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畜牧兽医学报 2024年第10期 4517-4529页

作者：张玉哲任善会姚威龚真莉张红强柳民意尤婷王相伟李积雲殷相平孙跃峰陈豪泰万学瑞甘肃农业大学中国农业科学院兰州兽医研究所重庆市万州区畜牧产业发展中心青海省科学技术信息研究所

利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台，构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)缺失TK基因毒株，为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因，利用Cre-LoxP系统平台，红色荧光蛋白(RFP)为... 详细信息

利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台，构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)缺失TK基因毒株，为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因，利用Cre-LoxP系统平台，红色荧光蛋白(RFP)为筛选标记，采用重叠PCR方法扩增左、右同源臂以及RFP基因表达框并进行融合，将其克隆至pUC19T载体，构建基因缺失转移载体pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。将转移载体重组质粒转染至Vero细胞，并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株，构建LSDV-ΔTK-RFP重组病毒。采取蚀斑法、有限稀释法纯化LSDV-ΔTK-RFP。然后，利用Cre-LoxP系统，在MDBK-Cre细胞中从病毒基因组中切除RFP标签，采取蚀斑法和有限稀释法筛选并纯化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及测序方法对重组毒株进行鉴定，并测定其一步生长曲线。结果表明成功构建缺失TK基因的重组毒株(LSDV-ΔTK),重组毒株复制力略低于野生毒株。应用Cre-LoxP系统构建的缺失TK基因LSDV毒株，具有良好的遗传稳定性和复制生长特性，为后续LSDV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株，同时拓展了Cre-LoxP系统的应用范围。

关键词：牛结节性皮肤病病毒 TK基因 Cre/LoxP系统重组毒株

来源：博看期刊

基于牛结节性皮肤病病毒ORF61基因荧光定量检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年第4期55卷 1800-1809页

作者：马春玲任善会杨雪蔺玉刚李积雲王相伟殷相平孙跃峰万学瑞陈豪泰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046 甘肃农业大学兰州730070 塔里木大学阿拉尔843300 青海省科学技术研究院信息研究所西宁810003

基于国内流行的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的基因组序列,建立了靶向ORF61基因的MGB探针荧光定量PCR检测方法。本研究基于LSDV基因序列设计出带有MGB探针的特异性荧光定量PCR引物,并进行特异性和灵敏性筛选验... 详细信息

基于国内流行的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的基因组序列,建立了靶向ORF61基因的MGB探针荧光定量PCR检测方法。本研究基于LSDV基因序列设计出带有MGB探针的特异性荧光定量PCR引物,并进行特异性和灵敏性筛选验证。最终,筛选得到靶向于LSDV ORF61基因的一对qPCR引物;利用pCAGGS-ORF61真核表达质粒,获得标准曲线y=-3.287 5x+47.87,线性相关系数R^(2)=0.998 6,扩增效率达101%;荧光定量PCR特异性、重复性和灵敏性试验结果表明,该引物的特异性高、重复性良好和灵敏度高等优点;该引物的最低检测限为6.71拷贝·μL^(-1),各批次内与批次间重复性结果的变异系数均小于2%。以上结果表明,作者建立特异性LSDV的荧光定量PCR检测方法,为LSD预防和控制提供有效的检测手段。

关键词：牛结节性皮肤病病毒 ORF61 MGB探针荧光定量PCR

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靶向山羊痘病毒GPCR基因SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年第10期 4779-4784页

作者：张红强任善会姚威龚真莉杨雪马春玲尤婷张玉哲柳民意钱文洁李柳杨余志鹏孙跃峰陈豪泰樊江峰甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所重庆市万州区畜牧产业发展中心

基于山羊痘病毒（goat pox virus, GTPV）的基因组序列，建立靶向G蛋白偶联趋化因子受体（G-protein-coupled chemokine receptor, GPCR）基因的荧光定量PCR检测方法。基于GTPV全基因序列设计6对qPCR引物，并进行特异性和灵敏性的筛选... 详细信息

基于山羊痘病毒（goat pox virus, GTPV）的基因组序列，建立靶向G蛋白偶联趋化因子受体（G-protein-coupled chemokine receptor, GPCR）基因的荧光定量PCR检测方法。基于GTPV全基因序列设计6对qPCR引物，并进行特异性和灵敏性的筛选和检测，最终筛选得到1对高特异性和灵敏性的荧光定量PCR引物；根据GTPV/AV41疫苗株GPCR基因序列，设计普通PCR引物，扩增GPCR基因，构建真核表达载体，建立荧光定量PCR标准曲线。结果表明：筛选得到1对靶向于GPCR基因的特异性qPCR引物；构建pCAGGS-GPCR真核表达质粒，建立标准曲线y=-3.5289x+49.07,线性相关系数R2=0.997 2,扩增效率为92.7%;验证性试验结果显示，该引物最低检测限为2.0拷贝·μL-1,各批次内与批次间重复性结果的变异系数均小于2%,表明其具有特异性强、重复性好和灵敏度高的优点。建立了靶向山羊痘病毒GPCR基因的qPCR检测方法，为防控山羊痘提供了高效的检测手段。

关键词：山羊痘病毒 GPCR 荧光定量PCR

来源：博看期刊

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羊口疮病毒ORF112基因缺失毒株的构建及增殖能力分析

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畜牧兽医学报 2024年

作者：尤婷任善会王萌张红强高小龙姚威王卉杨雪马春玲柳民意张玉哲王金龙孙跃峰陈豪泰王桂荣甘肃农业大学中国农业科学院兰州兽医研究所青海大学动物科技学院重庆市万州区畜牧产业发展中心

利用同源重组技术构建羊口疮病毒（orf virus， ORFV）ORF112基因缺失毒株，为后续研制出高效、安全的ORFV基因工程疫苗提供候选毒株。以ORF112基因为靶基因，通过重叠PCR的方法将左、右同源臂及绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达框，进行... 详细信息

利用同源重组技术构建羊口疮病毒（orf virus， ORFV）ORF112基因缺失毒株，为后续研制出高效、安全的ORFV基因工程疫苗提供候选毒株。以ORF112基因为靶基因，通过重叠PCR的方法将左、右同源臂及绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达框，进行融合后与pUC19T载体连接，构建出pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP基因转移载体。将转移载体重组质粒转染到Vero细胞与WT-ORFV基因组进行同源重组。采取有限稀释法和挑取单细胞克隆法，筛选并纯化出纯合的ORFV-ΔORF112-EGFP毒株，并对该基因缺失毒株遗传稳定性和增殖特性等进行研究。结果显示：利用有限稀释和挑取单细胞克隆方法，进行阳性重组病毒纯化，通过PCR验证和测序，成功的获得ORFV-ΔORF112-EGFP重组毒株。该重组毒株在系列传代过程中EGFP稳定表达且无减弱现象。该重组ORFV-ΔORF112-EGFP毒株与野生毒株的复制生长特性基本一致。成功构建并筛选得到纯化的ORFV-ΔORF112-EGFP基因缺失毒株，该毒株具有良好的遗传稳定性和复制能力，为后续ORFV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株。

关键词：羊口疮病毒 112基因同源重组基因缺失

METTL3表达水平对口蹄疫病毒复制的影响

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中国兽医科学 2024年第8期54卷 1010-1018页

作者：张继燕李伟伟范许许曹雪静朱兆宇裴丹诗王一卓何路李熙忠任青峰张伟王川郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730000 河南农业大学动物医学院河南郑州450046 甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070

利用CRISPR/Cas9系统构建了METTL3基因敲除细胞系(BHK-21),随后用口蹄疫病毒(FMDV)分别感染野生型和METTL3敲除BHK-21细胞,通过q PCR、Western-blot和TCID50方法检测FMDV在上述2株细胞中的复制情况。结果表明,敲除METTL3显著抑制FMDV的... 详细信息

利用CRISPR/Cas9系统构建了METTL3基因敲除细胞系(BHK-21),随后用口蹄疫病毒(FMDV)分别感染野生型和METTL3敲除BHK-21细胞,通过q PCR、Western-blot和TCID50方法检测FMDV在上述2株细胞中的复制情况。结果表明,敲除METTL3显著抑制FMDV的复制。为了进一步验证METTL3的表型功能,利用慢病毒包装系统构建METTL3稳定表达细胞系。用FMDV分别感染野生型和METTL3过表达BHK-21细胞,通过q PCR和TCID50试验测定FMDV在这2株细胞中的复制情况。结果显示,过量表达METTL3促进FMDV的复制。此外,激光共聚焦显微镜试验显示,FMDV感染BHK-21细胞后,METTL3从细胞核迁移至细胞质,其细胞定位的改变表明METTL3可能参与调控FMDV基因组的转录过程。本研究中成功构建了METTL3基因敲除和过表达的BHK-21细胞系,首次发现该分子正向调控FMDV的复制。上述实验结果为进一步开展METTL3在宿主细胞中调控FMDV复制的机制研究奠定了可靠的数据基础。

关键词： METTL3 m6A修饰口蹄疫病毒

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