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细胞自噬相关蛋白ATG9A对口蹄疫病毒侵入的影响

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中国兽医科学 2024年第3期54卷 285-291页

作者：邓欣雨袁红王涛宫晓华赵俊芳包慧芳李平花孙普付元芳李坤刘在新卢曾军白兴文中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为揭示细胞自噬相关蛋白9A(ATG9A)对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,利用IFA、RT-qPCR和Western-blot等方法检测FMDV与ATG9A的共定位情况以及病毒感染对ATG9A的影响;通过构建ATG9A重组表达质粒和合成小干扰RNA,检测过表达及敲降ATG9A对FMD... 详细信息

为揭示细胞自噬相关蛋白9A(ATG9A)对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,利用IFA、RT-qPCR和Western-blot等方法检测FMDV与ATG9A的共定位情况以及病毒感染对ATG9A的影响;通过构建ATG9A重组表达质粒和合成小干扰RNA,检测过表达及敲降ATG9A对FMDV吸附、内化、基因组复制、蛋白翻译、子代病毒粒子产生的影响。结果显示,FMDV感染后与ATG9A共定位且抑制ATG9A的表达;ATG9A不影响FMDV的吸附,但极显著地抑制FMDV的内化过程;同时,过表达(或干扰)ATG9A能够在RNA与蛋白水平显著降低(或提高)FMDV的增殖和子代病毒粒子产生的能力。结论,ATG9A抑制FMDV的复制,为深入认识FMDV在细胞内的复制周期提供了线索。

关键词：自噬相关蛋白9A 口蹄疫病毒内化复制

一种新型T细胞免疫原的原核表达及对口蹄疫疫苗的免疫增强作用

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生物工程学报 2011年第9期27卷 1281-1291页

作者：赵清孙普刘在新李平花包慧芳曹轶梅白兴文付元芳卢曾军李冬中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒VP1蛋白的串联编码... 详细信息

主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒VP1蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗(P<0.01)和OA-VP1免疫组(P<0.05)小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+T细胞数量显著增多I,FN-γ产生水平显著升高(P<0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成分,以提高疫苗的免疫效果。

关键词：口蹄疫病毒 T细胞表位 T细胞免疫原灭活疫苗亚单位疫苗

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB双抗体夹心EliSA方法的建立

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生物工程学报 2020年第11期36卷 2357-2366页

作者：付元芳何伟孙普杨林包慧芳曹轶梅白兴文李平花李冬陈应理刘磊卢曾军刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

抗原纯净度是口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)灭活疫苗质量检验的一项重要内容,一般采用疫苗2–3次免疫动物后,检测非结构蛋白(Non-structural protein,NSP)抗体是否阳转,判断疫苗抗原的纯净度。文中旨在建立定量检测FMD灭活疫苗抗... 详细信息

抗原纯净度是口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)灭活疫苗质量检验的一项重要内容,一般采用疫苗2–3次免疫动物后,检测非结构蛋白(Non-structural protein,NSP)抗体是否阳转,判断疫苗抗原的纯净度。文中旨在建立定量检测FMD灭活疫苗抗原中NSP 3AB含量的EliSA方法,为疫苗质量控制提供参考方法。利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)NSP 3A单克隆抗体和辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记的3B单克隆抗体,建立定量检测NSP 3AB含量的双抗体夹心EliSA检测方法。采用原核表达并纯化的3AB蛋白作为标准品,标准品系列稀释,绘制标准曲线,以标准品与未加抗原的阴性对照吸光值(OD)的比值大于2.0的标准品最低浓度为最低检测限。标准品浓度介于4.7–600.0 ng/mL之间时,测得的OD值与浓度呈线性相关,回归曲线呈直线,相关系数R2=0.99,确定最低检测限为4.7 ng/mL。检测12份未纯化灭活抗原中3AB蛋白含量介于9.3–200.0 ng/mL之间;而纯化后的病毒抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限;33份来自不同厂家的成品疫苗抗原中9份疫苗抗原3AB蛋白含量在9.0–74.0 ng/mL之间,其余24份疫苗抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限。检测3AB蛋白含量的双抗体夹心EliSA方法能够特异、敏感地检测疫苗抗原中的3AB蛋白含量,为疫苗质量控制与纯净度检验提供了一种可供选择的检测方法。

关键词：口蹄疫非结构蛋白定量EliSA 疫苗抗原纯净度

不同长度poly(C)对口蹄疫病毒基因工程毒的毒力影响

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微生物学报 2008年第12期48卷 1654-1658页

作者：白兴文李平花孙普李永亮包慧芳卢曾军曹轶梅郭建宏刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

【目的】研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)poly(C)区段的序列长度与FMDV毒力之间的关系。【方法】首先利用NheⅠ/NotⅠ线化FMDV pGEM-XJ/AKT/69全长重组质粒,制备体外转录本,借助lipofectamine 2000转染BHK-21细胞,获得基因工程毒。随后,在细胞传代过程中,收取不同代数病毒培养液,提取总RNA进行poly(C)的长度测定,并进行乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID_(50)的测定。【结果】我们发现,基因工程毒在BHK-21上连续传代至第6代时,可见明显的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE);在经过一代乳鼠接种之后再重新适应到BHK-21细胞的过程中,poly(C)区段出现了缩短现象;乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID_(50)测定结果表明,尽管基因工程毒与母本毒相比毒力偏低,但含有不同长度poly(C)的基因工程毒之间并无显著差异。【结论】poly(C)区段的序列长度在12～17个C之间改变对FMDV基因工程毒的毒力无明显的影响。

关键词：口蹄疫病毒基因工程毒 poly(C) 毒力

VP3 G–H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响

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微生物学报 2019年第7期59卷 1285-1294页

作者：陈冬冬白兴文宫晓华包慧芳李平花李冬付元芳白启峰袁红孙普马雪青曹轶梅陈应理卢曾军刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室OIE/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 兰州大学基础医学院甘肃省新药临床前研究重点实验室甘肃兰州730000

【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和L... 详细信息

【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和LD50的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测。【结果】结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力。【结论】VP3上第3174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G-H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用。

关键词：口蹄疫病毒 VP3 G-H环定点突变体生物学特性内吞作用

一起荷斯坦奶牛乳头瘤病诊断及其病毒基因型分析

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病毒学报 2021年第6期37卷 1459-1465页

作者：孙普马雪青李平花朱新荣扎西英派白兴文包慧芳卢曾军刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046 甘肃荷斯坦奶牛繁育示范中心兰州730080 西北民族大学兰州730030

牛乳头瘤病毒是一种能够引起牛发生皮肤乳头状瘤、纤维素瘤、膀胱和食道癌的DNA病毒,现已在牛群中广泛传播,对牛养殖业造成了重大经济损失。为了诊断甘肃某荷斯坦奶牛场300多头泌乳期奶牛乳头突发疣状物的病因,本研究采用流行病学调查... 详细信息

牛乳头瘤病毒是一种能够引起牛发生皮肤乳头状瘤、纤维素瘤、膀胱和食道癌的DNA病毒,现已在牛群中广泛传播,对牛养殖业造成了重大经济损失。为了诊断甘肃某荷斯坦奶牛场300多头泌乳期奶牛乳头突发疣状物的病因,本研究采用流行病学调查、临床观察、组织病理学、分子生物学检测方法和基因测序技术,对患有疣状物的奶牛进行综合诊断。结果表明,乳头患疣状物奶牛的其它部位无类似生长物,无发烧、疼痛等异常临床症状,组织病理学HE检测疣状物呈现角化过度和细胞空泡化现象,这与牛乳头瘤病毒感染的组织病理变化相似,并且用PCR方法获得了牛乳头状瘤病毒L1基因,测序比对结果显示为乳头瘤病毒7型基因,核苷酸同源性达98%以上。因此,本次荷斯坦奶牛乳头突发疣状物为乳头瘤病毒7型感染引起的,这是甘肃地区首次发现该基因型乳头瘤病毒,应引起奶牛场与防疫部门的重视。

关键词：乳头瘤病毒诊断基因型

口蹄疫灭活疫苗的免疫效果及其对鉴别诊断的干扰

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畜牧兽医学报 2020年第10期51卷 2481-2489页

作者：孙普何伟付元芳李冬杨林魏德陇曹轶梅李平花白兴文马雪青李坤包慧芳张婧朱新荣刘在新卢曾军中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 甘肃农业大学兰州730070 甘肃荷斯坦奶牛繁育示范中心兰州730086

灭活疫苗免疫是防控口蹄疫的重要措施,但是灭活疫苗的免疫效果及其对感染与免疫鉴别诊断的干扰一直是口蹄疫免疫无疫区建设评估需要明确的重要问题。本研究中选择了3个企业(代号A、B与C)的4组口蹄疫O型与A型二价灭活疫苗,分别免疫口蹄... 详细信息

灭活疫苗免疫是防控口蹄疫的重要措施,但是灭活疫苗的免疫效果及其对感染与免疫鉴别诊断的干扰一直是口蹄疫免疫无疫区建设评估需要明确的重要问题。本研究中选择了3个企业(代号A、B与C)的4组口蹄疫O型与A型二价灭活疫苗,分别免疫口蹄疫抗体阴性健康未成年牛,免疫3~4次,测定免疫前后结构蛋白和非结构蛋白抗体的应答水平。结果显示:(1)结构蛋白抗体合格率:a1组(A企业多批次疫苗)4次免疫后O型和A型均为100%;a2组(A企业同批次疫苗)一~三免O型为36.7%、98.3%与100%,A型为15%、86.7%与100%;b组(B企业疫苗)一~三免O型为18.3%、97%与100%,A型为1.7%、45%与53.3%;c组(C企业疫苗)一~三免O型为26.7%、96.7%与100%,A型为21.7%、71.7%与100%。(2)非结构蛋白3ABC抗体阳性率(两种方法复核结果):a1组一~四免分别为0.7%、1.4%、9.5%与4.8%;a2组和c组三次免疫均未检测到阳性;b组仅三免后阳性率为0.6%。3组灭活疫苗首次免疫牛的抗体合格率远不及70%,但加强免疫后抗体合格率均显著提高;非结构蛋白抗体检测结果表明有3组疫苗的抗原纯净度符合OIE的要求,但a1组灭活疫苗免疫后,仍然对感染与免疫鉴别诊断存在干扰;采用两种非结构蛋白抗体检测方法进行复核检验,可以提高感染与免疫鉴别诊断的准确性。本研究为口蹄疫免疫无疫评价方案的制定提供了科学依据。

关键词：口蹄疫灭活疫苗免疫效果抗原纯净度鉴别诊断

A型塞内卡病毒HBWH/1/2018株的分离鉴定及全基因组序列测定

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中国动物传染病学报 2023年第1期31卷 146-152页

作者：马雪青祁光宇李平花付元芳白兴文包慧芳孙普卢曾军刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 中农威特生物科技股份有限公司兰州730000

为了鉴定湖北省某猪场水疱性疾病的病原,本研究采用RT-PCR、细胞分离培养、间接免疫荧光检测、电镜观察、病毒基因序列测定及分子进化分析的方法对湖北省某猪场采集的具有水疱样病变的猪水疱皮样品进行了病毒的分离和鉴定及全基因组序... 详细信息

为了鉴定湖北省某猪场水疱性疾病的病原,本研究采用RT-PCR、细胞分离培养、间接免疫荧光检测、电镜观察、病毒基因序列测定及分子进化分析的方法对湖北省某猪场采集的具有水疱样病变的猪水疱皮样品进行了病毒的分离和鉴定及全基因组序列的测定。结果表明:成功分离到1株A型塞内卡病毒(SVA),命名为HBWH/1/2018株。该毒株接种BHK-21细胞培养能够引起明显的致细胞病变效应;免疫荧光试验结果为阳性;病毒滴度为10^(9.35) TCID_(50)/0.1mL;该毒株基因组全长7281 bp(不包括Poly A),开放阅读框为6546 bp,编码2181个氨基酸;VP1核苷酸序列的遗传进化分析表明HBWH/1/2018株与HN01/2017株亲缘关系最近(相似性高达99.4%),而与SVA原型毒株SVV-001株的亲缘关系最远(相似性为91.3%)。本研究不仅丰富了SVA的分子流行病学数据,也为进一步研究SVA的致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础。

关键词：塞内卡病毒分离鉴定进化分析