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人源IL-21增强细胞因子诱导杀伤细胞抗白血病作用及其机制研究

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中华血液学杂志 2012年第10期33卷 823-828页

作者：赵楠赵明峰 sajin rajbhandary 卢文艺朱海波肖霞邓琦李玉明天津医科大学一中心临床学院 300192 天津医科大学血液科 300192

目的研究IL-21对外周血来源的细胞因子诱导杀伤细胞（CIK细胞）抗白血病作用及其机制。方法采集分离正常人外周血单个核细胞，加用细胞因子诱导培养，用MTT法检测CIK细胞的增殖能力及其对白血病细胞系K562细胞的杀伤作用；用流式细胞术... 详细信息

目的研究IL-21对外周血来源的细胞因子诱导杀伤细胞（CIK细胞）抗白血病作用及其机制。方法采集分离正常人外周血单个核细胞，加用细胞因子诱导培养，用MTT法检测CIK细胞的增殖能力及其对白血病细胞系K562细胞的杀伤作用；用流式细胞术检测CIK细胞免疫表型及其表面IL021受体（IL-21R）、FasL、细胞内穿孔素和颗粒酶B的表达；半定量RT—PCR法检测CIK细胞IFN-γ，TNF-α、TNF-β、穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B、FasL和NKG2DmRNA的表达；酶联免疫法检测培养上清中IFN-γ和TNF-α的表达；Westernblot法检测CIK细胞JAK—STAT信号途径的变化。结果在IL-21作用下，CIK细胞的产生由（17．5±4．7）％升至（26．5±2．1）％，对K562细胞的杀伤作用由（22．8±2．8）％升至（44．6±8．3）％，CIK细胞表面IL-21R的表达增加约2倍。CIK细胞IFN-1mRNA的表达由0．3760±0．2358升至0．7786±0．2493，TNF-αmRNA的表达由0．6557±0．1598升至1．3145±0．2136，穿孔素mRNA的表达由0．6361±0．1457升至0．9831±0．1265，颗粒酶BmRNA的表达由0．4084±0．1589升至0．7319±0．1639，FasLmRNA的表达由0．4015±0．2842升至0．7381±0．2568，差异均有统计学意义。CIK细胞表面FasL的表达水平，加IL-21组（0．19％）与未加IL-21组（0．04％）相比，差异有统计学意义。CIK细胞内穿孔素的表达由35．28％升至53．16％，颗粒酶B的表达由43．16％升至78．82％，培养上清中IFN．1的表达由（25．8±6．1）ng／L升至（56．0±2．3）ng／L，TNFα的表达由（5．64±0．61）μg/L升至（15．14±0．93）μg／L。STAT3和STAT5b的表达增加。结论人源IL-21可增强外周血来源CIK细胞抗白血病作用，此作用是通过增加其受体的表达，增加穿孔素、颗粒酶B、FasL、IFN-γ和TNFα的表达而实现的，JAK—STAT细胞信号途径的激活是此种作用的机制之一。提示IL-21在增强白血病免疫治疗中具有潜在的临床应用前景。

关键词：受体,白细胞介素21 细胞因子诱导杀伤细胞抗白血病作用作用机制

铁过载催化的氧化应激对骨髓间充质干细胞的影响及其作用机制

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中国医学科学院学报 2013年第1期35卷 6-12页

作者：卢文艺赵明峰 sajin rajbhandary 赵楠谢芳肖霞穆娟李玉明天津医科大学一中心临床学院天津市第一中心医院血液科天津300192

目的探讨铁过载催化的活性氧(ROS)生成对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法体外培养MSCs,加入不同浓度(100、200、400μmol/L)的枸橼酸铁铵(FAC),培养12、24、48 h,建立铁过载模型,测定铁过载前后细胞内... 详细信息

目的探讨铁过载催化的活性氧(ROS)生成对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法体外培养MSCs,加入不同浓度(100、200、400μmol/L)的枸橼酸铁铵(FAC),培养12、24、48 h,建立铁过载模型,测定铁过载前后细胞内的不稳定铁池(LIP)和ROS水平,并采用群体倍增时间(DT)检测MSCs的细胞增殖能力,采用Annexin V-PI双标法检测细胞凋亡率,进行蛋白质印迹实验检测磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(P-p38MAPK)、p38MAPK、蛋白激酶B(AKT)及p53蛋白的表达情况。结果铁过载组MSCs的LIP水平明显高于对照组(平均荧光强度482.49±20.96比303.88±23.37,P<0.05);ROS的水平随FAC浓度增加而升高,在加入FAC浓度为400μmol/L时最高(P<0.05)。用400μmol/L的FAC分别处理12、24、48 h的MSCs DT分别为(1.47±0.11)、(1.80±0.13)、(2.04±0.14)d,均明显长于对照组的(1.20±0.05)d(P均<0.05)。铁过载组MSCs的凋亡率也明显高于对照组[(3.51±1.17)%比(0.66±0.62)%,P<0.05]。与对照组比较,铁过载组P-p38MAPK、p38MAPK、p53蛋白的表达增加,而AKT的表达无明显差异。结论铁过载可通过提高骨髓MSCs的ROS水平来抑制其增殖、诱导其凋亡,此过程可能与p38MAPK-p53信号通路的激活有关。

关键词：铁过载间充质干细胞活性氧 p38丝裂原活化蛋白激酶 p53

IL-21联合IL-6增强脐血CIK细胞杀伤K562及HL-60细胞的作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2014年第2期34卷 123-127页

作者：孟娟霞赵楠 sajin rajbhandary 卢文艺柴笑赵明峰邓琦肖霞穆娟李青李玉明天津医科大学一中心临床学院 300192 天津市第一中心医院血液科 300192

目的探讨IL-21联合IL-6对脐血来源的CIK细胞杀伤K562及HL-60白血病细胞系效应的影响。方法Fieoll法分离脐血单个核细胞，加入细胞因子诱导培养CIK细胞并分为4组：对照组，IL-21组，IL-6组，IL-21±IL-6联合组。流式细胞术检测CIK细胞免... 详细信息

目的探讨IL-21联合IL-6对脐血来源的CIK细胞杀伤K562及HL-60白血病细胞系效应的影响。方法Fieoll法分离脐血单个核细胞，加入细胞因子诱导培养CIK细胞并分为4组：对照组，IL-21组，IL-6组，IL-21±IL-6联合组。流式细胞术检测CIK细胞免疫表型及Treg细胞的表达；CCK_8法检测细胞的增殖活性；LDH释放法检测CIK细胞对K562及HL-60细胞的杀伤作用。结果在细胞培养的第7天，与对照组相比，IL-21组CIK细胞的产生由（7．30±1．20）％上升至（12．52±1．45）％，IL-6组升至（11．01±1．04）％，IL-21±IL-6组升至（20．80±2．33）％，而IL-21组Treg细胞表达由（26．18±1．03）％降至（10．95±1．49）％，IL-6组降至（17．91±1．95）％，IL-21±IL-6组降至（5．25±0．54）％；在第14天，IL-21与IL-6组的CIK细胞比例为对照组的2倍，IL-21＋IL-6组为对照组的2．5倍，而Treg细胞比例在IL-21组由（9．24±0．42）％降至（1．48±0．06）％，IL-6组降至（3．96±0．11）％；IL-21＋IL-6组Treg细胞降至（0．83±0．08）％。在效靶比为20：1时，对照组细胞对K562及HL-60细胞的杀伤率[（29．31±0．58）％、（20．14±1．27）％]均明显低于各实验组（P〈O．01），而IL-21＋IL-6联合组对两种细胞的杀伤率[（63．79±0．91）％、（41．53±1．43）％]均高于IL-21组[（52．99±1．26）％、（33．04±1．68）％]和IL-6组[（53．05±1．52）％、（32．18±3．83）％]（P〈0．01），IL-21与IL-6组间差异无统计学意义。结论IL-21和IL-6可增强脐血来源的CIK细胞增殖与杀伤活性，同时可显著降低Treg细胞的表达，从而间接增强CIK细胞的功能；而且，二者协同使用效果更强，使CIK细胞对K562及HL-60白血病细胞系发挥更强大的杀伤作用，具有潜在的临床应用价值。

关键词：白细胞介素21 白细胞介素6 细胞因子诱导的杀伤细胞调节T细胞抗白血病作用

内源性表达白细胞介素21的CIK细胞的抗白血病作用及其机制

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中华医学杂志 2013年第4期93卷 293-299页

作者：赵楠赵明峰 sajin rajbhandary 卢文艺朱海波马立游权肖霞邓琦李玉明天津医科大学一中心临床学天津300192 天津市第一中心医院血液科

目的研究内源表达白细胞介素2l（IL-21）对外周血来源的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）抗自血病的作用及其作用机制。方法采集分离健康人外周血单个核细胞，加用细胞因子诱导培养CIK细胞，构建表达IL-21基因的慢病毒载体，感染CIK... 详细信息

目的研究内源表达白细胞介素2l（IL-21）对外周血来源的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）抗自血病的作用及其作用机制。方法采集分离健康人外周血单个核细胞，加用细胞因子诱导培养CIK细胞，构建表达IL-21基因的慢病毒载体，感染CIK细胞并鉴定后，四甲基偶氮唑盐（Mqq＂）法检测CIK细胞的增殖能力及杀伤白血病细胞系K562细胞作用；半定量反转录（RT）-PCR法检测CIK细胞干扰素1（IFN-y）、肿瘤坏死因子0（***）、TNF．B、穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B、Fas配体（FasL）和NKG2D分子（NKG2D）的mRNA表达；流式直接免疫标记法检测CIK细胞免疫表型、细胞表面IL-21受体（IL．21R）、FasL及细胞内穿孔素、颗粒酶B的表达；酶联免疫法检测培养上清中IFN-^v和TNF-OL的表达。结果经酶切与测序鉴定，IL-21慢病毒载体构建正确，共转染CIK细胞中有目的基因IL-21的表达。（1）与空载体组相比，内源表达IL-21组总的细胞增殖之间差异无统计学意义（P=0．856），内源表达IL-21组CIK细胞阳性细胞数高于空载体组（24．60％±2．10％比16．95％±4．70％，P=0．042）。（2）内源表达IL．21组CIK细胞对K562细胞的杀伤率高于空载体组（58．4％±8．3％比23．3％±2．8％，P=0．009），作用第5天时，杀伤作用仍能维持在61．2％±6．2％（P：0．003），相比外源性IL-21作用的CIK细胞的杀伤率（44．6％±8．3％比22．8％±2．8％，P=0．034）更强，而且作用时间更长久。（3）内源表达IL-21组CIK细胞表面IL-21R的表达比空载体组增加约2倍。（4）与空载体组比较，内源表达IL-21组CIK细胞IFN--,／和TNF-仪mRNA的表达升高约1．5倍，穿孔素、颗粒酶B、FasLmRNA的表达量升高近2倍，颗粒酶A、TNF-B和NKG2DmRNA的表达与空载体组差异无统计学意义。（5）对mRNA表达差异有统计学意义的指标进-步行蛋白质表达的检测发现：内源表达IL-21组CIK细胞表面FasL、穿孔素、颗粒酶B、IFN-y、TNF-a的表达水平均高于空载体组0．56％±0．37％比0．06％±0．02％、25．86％±6．13％比12．23％-4-2．35％、37．58％±2．30％比14．56％±1．36％、（55．3±3．5）ng／L比（23．2±5．6）．g／L、（15．6±0．6）斗∥L比（5．6±0．6）μg／L，均P〈0．05]。结论内源表达IL，21的CIK细胞具有更强的抗白血病作用，而且作用时间更长久，此作用可能是通过增加其受体的表达，增加穿孔素、颗粒酶B、FasL、IFN-y和TNF-a.

关键词：白血病细胞因子诱导杀伤细胞白细胞介素21 抗白血病作用

活性氧介导铁过载对脐带间充质干细胞及其造血支持作用的研究

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中华医学杂志 2013年第12期93卷 930-934页

作者：卢文艺赵明峰柴笑孟娟霞赵楠 sajinrajbhandary 徐新女马立李玉明天津医科大学一中心临床学院天津市第一中心医院血液科 300192 卫生部急救医学重点实验室

目的探讨铁过载对脐带间充质干细胞（UC-MSC）的损伤作用及活性氧物质（ROS）在该机制中的意义。方法体外培养***，用不同浓度的枸橼酸铁胺（FAC）处理UC-MSC不同时间建立铁过载模型。采用细胞倍增时间计算细胞的增殖能力；用AnnexinV... 详细信息

目的探讨铁过载对脐带间充质干细胞（UC-MSC）的损伤作用及活性氧物质（ROS）在该机制中的意义。方法体外培养***，用不同浓度的枸橼酸铁胺（FAC）处理UC-MSC不同时间建立铁过载模型。采用细胞倍增时间计算细胞的增殖能力；用AnnexinV／PI双染法检测细胞的凋亡；用共培养方法检测UC-MSC的造血支持能力；并用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平；Western印迹法检测铁过载及抗氧化处理后UC-MSC内ROS相关信号蛋白p-p38MAPK、p38MAPK及1953的表达。结果（1）加铁组UC-MSC的群体倍增时间明显长于对照组[第3代细胞：（24．43±2．72）h比（16．03±2．31）h，P〈0．05]，但传代次数增加2代后两组之间差异无统计学意义（P〉0．05）；（2）加铁组UC-MSC的凋亡率（12．75％±0．32％）明显高于对照组（3．63％±0．80％）（P〈0．05）；（3）脐血单个核细胞（MNC）与加铁组UC-MSC共培养1和2周时，其造血集落形成能力均明显低于对照组（均P〈0．05）；（4）加铁组UC-MSC内ROS水平明显高于对照组，且ROS的水平呈时间与浓度依赖性，在400LLm0L／LFAC浓度下作用12h达到最高值（1499±86比548±97，P〈0．05）；（5）加铁组UC-MSC的p-p38MAPK、P53蛋白表达明显高于对照组，当给予抗氧化剂处理后，相关信号通路可被抑制。结论铁过载可能通过激活ROS相关信号传导因子p-p38MAPK、1953抑制UC-MSC的增殖能力，诱导其凋亡，降低其造血支持能力。

关键词：铁超负荷间质干细胞脐带活性氧物质信号传导