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嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.F2.过氧化氢酶的分离纯化及性质研究(英文)

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生物工程学报 2005年第1期21卷 71-77页

作者：张心齐薛燕芬赵爱民堵国成许正宏陈坚马延和中国科学院微生物研究所北京100080 中国生物技术发展中心北京100081 江南大学教育部工业生物技术重点实验室无锡214036

从一株低度嗜盐、兼性嗜碱芽孢杆菌Bacillussp .F2.6中纯化得到一种碱性过氧化氢酶 ,并对该酶进行了性质研究。纯化过程经硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析及疏水层析四步最终获得电泳纯的目标酶 (纯化 5 8 5倍 )。该过氧化氢... 详细信息

从一株低度嗜盐、兼性嗜碱芽孢杆菌Bacillussp .F2.6中纯化得到一种碱性过氧化氢酶 ,并对该酶进行了性质研究。纯化过程经硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析及疏水层析四步最终获得电泳纯的目标酶 (纯化 5 8 5倍 )。该过氧化氢酶的分子量为 14 0kD ,由两个大小相同的亚基组成。天然酶分子在 4 0 8nm处显示特征吸收峰 (Soretband)。吡啶血色素光谱显示了酶分子以原卟啉Ⅸ (protohemeⅨ )作为辅基。计算获得酶的表观米氏常数为 3.0} 5mmol L。该过氧化氢酶不受连二亚硫酸钠的还原作用影响 ,但被氰化物、叠氮化物和 3.氨基_1,2.,4_三唑 (单功能过氧化氢酶的专一抑制剂 )强烈抑制。以邻联茴香胺、邻苯二胺和二氨基联苯胺作为电子供体测定酶活时 ,该酶不显示过氧化物酶活性。同时 ,酶的N_端序列比对结果说明 ,该过氧化氢酶与单功能过氧化氢酶亚群有一定的相似性 ,而与双功能过氧化氢酶亚群及猛过氧化氢酶亚群均没有同源性。因此 ,本文将纯化的碱性过氧化氢酶定性为单功能过氧化氢酶。此外 ,该酶具有热敏感的特点 ,且酶活在pH 5～ 9的范围内不受pH影响 ,此后 ,活性随着pH的升高而升高 ,并在pH 11处有明显的酶活高峰。 2.0℃、pH 11条件下的酶活半衰期达 4 9h。在pH

关键词：过氧化氢酶 Bacillus

利用木糖和葡萄糖合成乙醇的新型重组大肠杆菌的研究

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微生物学报 2004年第5期44卷 600-604页

作者：孙金凤徐敏张峰王正祥江南大学生物工程学院分子生物学研究室和工业生物技术教育部重点实验室无锡214036

利用PCR方法从运动发酵单孢菌染色体DNA扩增出乙醇合成途径的关键酶基因pdc、adhB ,分别用tac启动子控制表达 ,构建了可以在EscherichiacoliJM10 9中表达的重组质粒pKK_PA、pEtac_PA。初步的乙醇发酵结果表明 ,在E .coli中只引入adhB基... 详细信息

利用PCR方法从运动发酵单孢菌染色体DNA扩增出乙醇合成途径的关键酶基因pdc、adhB ,分别用tac启动子控制表达 ,构建了可以在EscherichiacoliJM10 9中表达的重组质粒pKK_PA、pEtac_PA。初步的乙醇发酵结果表明 ,在E .coli中只引入adhB基因不能拓宽其中的产乙醇途径 ,引入pdc基因可以与宿主自身的ADH酶协同作用 ,使碳流有效导向产乙醇方向。同时引入pdc、adhB基因可以在宿主E .coli中成功建立产乙醇途径。

关键词：重组大肠杆菌乙醇发酵

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一种快速提取真菌染色体DNA的方法

微生物学通报 2004年第4期31卷 89-92页

作者：周小玲沈微饶志明王正祥诸葛健江南大学工业微生物研究中心江南大学教育部重点实验室无锡214036

介绍了一种适用于多种真菌染色体DNA的快速提取方法。该方法用石英砂振荡破壁 ,快速便捷地提取真菌染色体DNA ,提取时间仅用 1～ 2.。作者应用该方法成功地提取了粗糙脉胞菌 (Neurosporacrassa)、米曲霉 (Aspergillusoryzae)、羊肚菌 (M... 详细信息

介绍了一种适用于多种真菌染色体DNA的快速提取方法。该方法用石英砂振荡破壁 ,快速便捷地提取真菌染色体DNA ,提取时间仅用 1～ 2.。作者应用该方法成功地提取了粗糙脉胞菌 (Neurosporacrassa)、米曲霉 (Aspergillusoryzae)、羊肚菌 (Morchellaesculcnta)、酿酒酵母 (Saccharomycescervisae)等 4种不同真菌的染色体DNA ,所提DNA片段均大于2.0kb ,可直接用于限制性内切酶酶切。

关键词：真菌染色体DNA 提取

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L-缬氨酸合成的代谢流量分析

生物工程学报 2004年第3期20卷 403-407页

作者：李秀敏李乃强杨毅姜绪林邱勇隽张星元江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214036 上海凯赛研发中心有限公司上海201203

分别测定谷氨酸棒杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)AS1 4 95及其 3.逐个叠加不同遗传标记的突变株AA3. 1、AAT2.3.和AATV3.1在特定培养时段 (2.6～ 2.8h)L 缬氨酸等代谢物的胞外浓度 ,由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累 (或消... 详细信息

分别测定谷氨酸棒杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)AS1 4 95及其 3.逐个叠加不同遗传标记的突变株AA3. 1、AAT2.3.和AATV3.1在特定培养时段 (2.6～ 2.8h)L 缬氨酸等代谢物的胞外浓度 ,由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累 (或消耗 )的速率 ,分别做出这 4株菌在拟稳态下的代谢流量分布图 ,进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加对代谢网络中L 缬氨酸合成流量分布的影响。结果表明遗传标记的引入使流量分配发生了重大变化 ,节点处的流量分配朝着有利于L 缬氨酸合成的方向改变。 6 磷酸葡萄糖节点处流入EMP途径和HMP途径的流量分配由 17 0∶83.0变为 2.4 3.75 7;丙酮酸节点处流入L 缬氨酸合成途径和其他途径的流量分配由 15 8∶84 2.为 76 7∶2.3.3.L 缬氨酸合成的分支途径上的流量由最初的 5 3.增大为 3. 3.乳酸合成途径的流量从 11 1最后降为 1 16 ,L 缬氨酸产量由 4g L提高到 2.4 5g L。代谢流量分布的变化趋势与L 缬氨酸产量的变化趋势是互相吻合的。以 2. 噻唑丙氨酸抗性突变 (2. TAr)和L 天冬氨酸氧肟酸盐超敏性突变 (L AAHss)有效地进行代谢流遗传导向的事实 ,在代谢流量分析的层面上 ,证明结构类似物抗性突变和结构类似物超敏性突变是代谢流导向和设计育种的十分有效的手段。

关键词： L-缬氨酸谷氨酸棒杆菌代谢流量分析

海洋悬浮颗粒物中氮同位素的EA-IRMS法测定

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台湾海峡 2003年第1期22卷 1-8页

作者：曹建平黄奕普刘广山陈敏李鸿宾江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214036 厦门大学海洋系福建厦门361005

本测定方法利用元素分析同位素质谱 (EA IRMS)分析系统 ,设计改装了一套适用于大气氮标定钢瓶氮同位素的封闭分析系统 ,并建立了测定悬浮颗粒物中氮同位素的分析方法 .将海水样品经 45 0℃预燃烧过的玻璃纤维滤膜过滤 ,获得悬浮颗粒... 详细信息

本测定方法利用元素分析同位素质谱 (EA IRMS)分析系统 ,设计改装了一套适用于大气氮标定钢瓶氮同位素的封闭分析系统 ,并建立了测定悬浮颗粒物中氮同位素的分析方法 .将海水样品经 45 0℃预燃烧过的玻璃纤维滤膜过滤 ,获得悬浮颗粒物 .设定大气δ1 5N值为零 ,连续进样 12. ,测定大气氮的δ1 5Nair 值为 ( 0 .0 2.0 .0 3.‰ ;并对参考气高纯钢瓶氮进行了标定 ,其δ1 5Nair值为 ( -0 .0 9± 0 .0 2.)‰ ;其离子强度在 0 .5 0～ 6 .0V之间具有良好的线性 ,样品分析精度优于 0 .15‰ .采用该方法实测 5 8份海水悬浮颗粒物 ,获得1 5N天然丰度平均值为 0 .3. 7% .

关键词：海洋元素分析-同位素质谱悬浮颗粒物氮同位素海水丰度

重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶的纯化及性质研究

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微生物学报 2002年第3期42卷 348-353页

作者：王凡强王正祥邵蔚蓝刘吉泉徐成勇诸葛健江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214036

将产热稳定性过氧化氢酶的重组大肠杆菌培养后菌体破碎得到的粗酶液经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE SephadexA 5 0离子交换层析、HiPrep 1 6 1 0Phenyl疏水作用层析、Su perdex2.0 0HR 1 0 3.0凝胶层析提纯后得到电泳纯的酶 ,比酶... 详细信息

将产热稳定性过氧化氢酶的重组大肠杆菌培养后菌体破碎得到的粗酶液经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE SephadexA 5 0离子交换层析、HiPrep 1 6 1 0Phenyl疏水作用层析、Su perdex2.0 0HR 1 0 3.0凝胶层析提纯后得到电泳纯的酶 ,比酶活达到 1 5 6 2.9U mg。此酶的最适温度为 70℃ ,最适pH7 0 ,在 6 0℃保温 6 0min酶活力基本不变 ,在pH3. 8的范围内比较稳定。此酶的Km 和Vmax分别为 7 75mmol L和 2.7 8mmol·min- 1·mg- 1。 1mmol L的Zn2.+ 、Ba2.+ 、Mn2.+可使该酶完全失活 ,KCN、NaN3.、Na2.S2.O4 、巯基乙醇对酶活力有抑制作用 ,5 0mmol

关键词：重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶纯化性质

整合型碱性蛋白酶基因工程菌中抗性基因的敲除

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微生物学通报 2003年第3期30卷 1-5页

作者：唐雪明邵蔚蓝王正祥方慧英诸葛健江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214036

利用大肠杆菌载体pET 2.8a和穿梭载体 pHY3. 0PL构建了敲除载体 pHK ,通过DNA变性技术和同源重组技术成功地敲除了整合型碱性蛋白酶基因工程菌BP0 71中的卡那霉素抗性基因 (Kanr) ,得到 11株敲除卡那霉素抗性基因的阳性克隆 ,并使产酶... 详细信息

利用大肠杆菌载体pET 2.8a和穿梭载体 pHY3. 0PL构建了敲除载体 pHK ,通过DNA变性技术和同源重组技术成功地敲除了整合型碱性蛋白酶基因工程菌BP0 71中的卡那霉素抗性基因 (Kanr) ,得到 11株敲除卡那霉素抗性基因的阳性克隆 ,并使产酶水平保持稳定。该方法的建立为基因敲除技术在工业微生物研究中应用提供了经验。

关键词：碱性蛋白酶基因工程菌BP071 抗性基因基因敲除

碱性蛋白酶工程菌发酵条件及重组酶的纯化和性质的研究

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生物工程学报 2002年第6期18卷 729-734页

作者：唐雪明王正祥邵蔚蓝刘吉泉方慧英诸葛健江南大学教育部工业生物技术重点实验室无锡214036

在 5L发酵罐中对重组碱性蛋白酶工程菌株BP0 71高产碱性蛋白酶的条件进行了研究 ,通过提高通气量和改变搅拌转速 ,BP0 71可在发酵 40h内达到产酶高峰 ,酶活力最高可达 2.44 80u mL。利用快速蛋白液相层析(FPLC)技术 ,建立了快速高效纯... 详细信息

在 5L发酵罐中对重组碱性蛋白酶工程菌株BP0 71高产碱性蛋白酶的条件进行了研究 ,通过提高通气量和改变搅拌转速 ,BP0 71可在发酵 40h内达到产酶高峰 ,酶活力最高可达 2.44 80u mL。利用快速蛋白液相层析(FPLC)技术 ,建立了快速高效纯化碱性蛋白酶的方案。发酵液通过硫酸铵沉淀、DEAE A 5 0脱色及聚乙二醇浓缩得粗酶 ,再经过CM Sephadex C 5 0、Sephadex G 75柱层析后得到了单一组份的重组碱性蛋白酶 ,酶纯度提高了 76 .2.。SDS -PAGE显示重组碱性蛋白酶分子量为 2.8kD。酶学性质研究表明 ,酶的最适作用pH为 11,最适作用温度为 6 0℃ ,具有良好的pH稳定性和热稳定性。Ca2.+、Mg2.+对酶的稳定性有促进作用 ,Hg2.+、Ag+、PMFS和DFP能强烈抑制酶的活力。

关键词：碱性蛋白酶工程菌发酵条件重组酶纯化性质

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微生物合成中链聚羟基烷酸酯研究进展

生物工程学报 2001年第5期17卷 485-490页

作者：严群李寅陈坚堵国成江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214036

某些微生物细胞在特定营养限制的条件下会产生聚羟基烷酸酯作为碳源储备。和短链聚羟基烷酸酯(PHB)一样 ,中链聚羟基烷酸酯由于具有更优良的性能、更高的附加值和更广泛的用途而受到人们的关注 ;此外 ,中链聚羟基烷酸酯还可以被人工合... 详细信息

某些微生物细胞在特定营养限制的条件下会产生聚羟基烷酸酯作为碳源储备。和短链聚羟基烷酸酯(PHB)一样 ,中链聚羟基烷酸酯由于具有更优良的性能、更高的附加值和更广泛的用途而受到人们的关注 ;此外 ,中链聚羟基烷酸酯还可以被人工合成为具有功能性侧链的半合成高聚物 ,并因此能够具有更好的弹性和更理想的结晶性能等优点 ,从而成为近年来对环境友好的生物可降解材料的研究重点。在能够合成中链聚羟基烷酸酯的微生物中 ,食油假单胞菌是最典型 ,也是研究得最多的一种。本文对由食油假单胞菌合成中链聚羟基烷酸酯的特点、代谢机制、发挥过程等内容进行了综述。

关键词：中链聚羟基烷酸酯食油假单胞菌生物合成可降解塑料