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重组猪α干扰素/白细胞介素-2的可溶性表达及体外活性研究

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农业生物技术学报 2024年第3期32卷 595-604页

作者：冯桂丹闫若潜马震原柴茂周建浩康台生王淑娟杨海波刘影谢彩华赵雪丽王翠河南农业大学动物医学院上海市动物疫病预防控制中心河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警与防控重点实验室河南科技大学动物科技学院

猪(Sus scrofa) α干扰素/白细胞介素-2 (porcine interferon α/porcine interleukin-2,PoIFN-α-linkerPoIL-2)在大肠杆菌(Escherichia coli)中多以包涵体形式表达，为在大肠杆菌系统中获得可溶性表达的具有活性的重组猪α干扰素/白介素2 (rPoIFN-α-linker-PoIL-2)蛋白，本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因进行可溶性改造并合成。将改造后的PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因克隆到表达载体p ET-32a(+)进行原核表达，采用镍铬亲和层析柱对表达的可溶性rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白进行纯化。分别采用淋巴细胞增殖检测法、ELISA方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白体外促猪外周血T淋巴细胞(peripheral blood T lymphocyte,PBLC)增殖活性，及其与抗猪白介素2单抗、抗猪α干扰素单抗发生特异性免疫反应的活性；采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在不同细胞系上抑制不同病毒的增殖活性。结果显示，PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因可在大肠杆菌中高效可溶性表达，表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白分子量大小约55 k D。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白经镍铬亲和层析柱纯化后纯度达90%以上。rPoIFN-α-linker-PoIL-2具有显著的促PBLC增殖活性(P<0.05)；可以与抗PoIL-2、PoIFN-α单抗发生特异性免疫反应。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在不同细胞上抑制不同病毒的增殖活性效价有差异，在猪肾细胞(porcine kidney cells,PK)-15、人羊膜细胞(human amniotic cells) WISH上抑制水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)增殖的活性单位分别为1.8×106和2.5×106IU/mg；在PK-15细胞上抑制伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)增殖的活性单位分别为2.2×104、1.3×105IU/mg；在非洲绿猴肾细胞(Verda Reno,Vero)上抑制猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)增殖的活性单位为3.2×104IU/mg。本研究获得了可溶性表达的rPoIFN-α-linkerPoIL-2蛋白，该蛋白在不同细胞上具有抑制VSV、PRV、SVA及PEDV等病毒增殖的活性，为进一步研究rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在猪体内的活性提供了基础资料。

关键词：猪α干扰素猪白细胞介素-2 嵌合基因可溶性表达体外活性

非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 118-130页

作者：刘影闫若潜王东方杨海波赵美雪宋丹赵雪丽谢彩华王淑娟马震原柴茂王翠刘梅芬河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应... 详细信息

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

关键词：非洲猪瘟病毒高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重FQ-PCR

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猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 413-418页

作者：周建浩王东方刘影王淑娟马震原谢彩华赵雪丽杨海波冯桂丹康台生胡煜锋李博文闫若潜河南农业大学动物医学院郑州450046 河南省动物疫病预防控制中心/河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008 河南科技大学动物科技学院洛阳471000 上海市动物疫病预防控制中心上海201103

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异... 详细信息

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

关键词：猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR 方法建立

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荧光定量PCR检测EDSV方法的建立与应用及NE4毒株感染特性的研究

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荧光定量PCR检测EDSV方法的建立与应用及NE4毒株感染特性的研究

作者：马震原四川农业大学

学位级别：硕士

鸡产蛋下降综合征病毒（Egg drop syndrome virus, EDSV）属于腺病毒科禽腺病毒属Ⅲ群（Avian adenovirus Group Ⅲ）。该病毒主要引起产蛋下降及卵壳形成不全等临床症状。李刚等于1991年分离到EDSV NE4株,从而证实了EDS在我国的存在。... 详细信息

鸡产蛋下降综合征病毒（Egg drop syndrome virus, EDSV）属于腺病毒科禽腺病毒属Ⅲ群（Avian adenovirus Group Ⅲ）。该病毒主要引起产蛋下降及卵壳形成不全等临床症状。李刚等于1991年分离到EDSV NE4株,从而证实了EDS在我国的存在。该病毒与牛腺病毒、羊腺病毒DNA具有高度同源性,而与Ⅰ型禽腺病毒的DNA没有同源性,推测EDSV可能是介于哺乳动物腺病毒和禽腺病毒之间的病毒类群。本论文针对鸡产蛋下降综合征病毒主要展开以下三部分研究：一是TaqMan荧光实时定量PCR检测鸡产蛋下降综合征病毒方法的建立及应用;二是鸡产蛋下降综合征病毒NE4株的动物回归试验;三是该毒株对小鼠感染特性的初步研究。 1.建立了TaqMan荧光实时定量PCR检测鸡产蛋下降综合征病毒方法：根据GenBank公布的EDSV六邻体蛋白基因的高度保守序列,设计了2对特异性引物和1条TaqMan探针。以构建的阳性重组质粒为标准品,构建标准曲线,建立了一种快速检测鸡产蛋下降综合征病毒的TaqMan荧光实时定量PCR方法。该方法最小检出量达10copies/μL,在1.0×102～1.0×108copies/μL检测范围间有良好的线性关系,具有较好的敏感性、特异性、稳定性和重复性。与普通PCR相比,用荧光实时定量PCR检测受感染鸡群产蛋分离物中病毒的方法具有更高的灵敏度,为鸡产蛋下降综合征病毒的进一步研究奠定了基础。 2.鸡产蛋下降综合征病毒NE4毒株进行动物回归试验,对鸡群进行抗体水平检测,并对分离样本中病毒含量进行监测：以106TCID50攻毒量的EDSV NE4株对10只120日龄罗曼鸡进行人工感染试验,同时设置自然感染组及阴性对照组。对临床症状及蛋鸡产蛋率进行监测发现,人工感染组没有明显的临床表现,产蛋率可下降至80%,自然感染组出现典型的产蛋异常,产蛋率下降至40%,阴性对照组临床表现正常;对攻毒后鸡群的卵黄抗体及血清抗体水平进行监测,结果显示人工感染与自然感染均可使鸡产生高达212的抗体,阴性对照组鸡群体内并未检测到抗体;用荧光定量PCR方法对鸡群所产蛋及排出粪便进行病毒检测,结果显示攻毒后第7d开始直至监测结束,可在人工感染组鸡群的粪便及蛋中检测到病毒,自然感染组鸡群所产软壳蛋中亦可检测到,阴性对照组鸡群受检样本检测为阴性。本次的动物回归试验证明了NE4株仍具有感染性,可使动物机体产生高滴度HI抗体并向外排毒,可通过水平传播自然感染健康鸡并使其产生高滴度HI抗体。 3.鸡产蛋下降综合征病毒NE4毒株对小鼠感染特性的初步研究：本文首次探索性地用106TCID50攻毒量的EDSV NE4株对4-6周龄的KM小鼠进行攻毒试验,同时以正常尿囊液接种作为阴性对照。对小鼠的临床表现及血清抗体水平进行监测发现,攻毒可使小鼠产生特异性的抗体,并对其采食有一定影响,血清中HI抗体滴度可高达212,阴性对照组小鼠体内抗体检测为阴性;用荧光定量PCR对小鼠组织中的EDSV进行检测,结果显示在攻毒后小鼠大部分组织器官如肝脏、子宫、肾脏、肺脏、脾脏、心脏、肠、食管、气管、脑与攻毒后7d-63d粪便中均可检测到EDSV,而被检组织在攻毒后不同时间EDSV的含量有所不同,阴性对照小鼠所有受检组织中均未检测到病毒;用纯化后的EDSV免疫新西兰白兔,将获得的高免血清用Protein A亲和层析柱纯化后,得到纯度及效价较高的抗EDSV多克隆抗体;用纯化的多抗结合免疫组化法对小鼠组织中的EDSV进行定位,结果显示攻毒后不同时间,在子宫、肺脏、肝脏、肾脏中可检测到阳性信号,最为典型的定殖位置是子宫腺体上皮细胞及肌层细胞的胞浆中,说明EDSV可在小鼠的组织中定殖。通过上述研究初步推测,EDSV NE4株可以感染KM小鼠。

关键词：鸡产蛋下降综合征病毒 NE4株荧光实时定量PCR 感染特性

口蹄疫病毒O型、A型和Asia I型三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

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中国动物传染病学报 2023年

作者：王翠赵雪丽王东方王淑娟马震原杨海波刘影柴茂谢彩华闫若潜河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室

为建立一种口蹄疫病毒（FMDV）O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR检测方法，本研究在比对多条FMDV基因的基础上，根据2B基因的最优保守区，设计O型、A型和Asia I型FMDV通用的反转录引物；再根据VP1基因的比对结果，以变异区为... 详细信息

为建立一种口蹄疫病毒（FMDV）O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR检测方法，本研究在比对多条FMDV基因的基础上，根据2B基因的最优保守区，设计O型、A型和Asia I型FMDV通用的反转录引物；再根据VP1基因的比对结果，以变异区为扩增靶区域，设计3对分别针对O型、A型和Asia Ⅰ型FMDV的特异性引物和TaqMan MGB探针。经优化反应体系和扩增程序等反应条件，建立一种基于探针技术的FDMV三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。验证该方法的特异性、敏感性和重复性，对15份临床疑似FMDV感染样品进行检测，并与基因测序方法及RT-PCR方法进行比较分析。本研究成功建立了FMDV三重FQ-PCR方法，实现了一步法对FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型病原样品的鉴别检测。该方法可特异性扩增FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型标准株细胞培养物，但对猪水疱性口炎病毒(VSV)等7种病原及阴性对照未出现扩增，特异性较强；对FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型阳性重组质粒标准品的最低检出限均可达到10 拷贝/μL，敏感性较高；批内/批间试验变异系数在0.48%～1.55%，重复性较好；利用建立的三重FQ-PCR方法对15份临床疑似FMDV感染样品进行检测，检测结果与基因测序结果完全一致，优于RT-PCR方法。本研究建立的三重FQ-PCR方法具有敏感性高、特异性强，在同一反应体系中能同时鉴别检测出FMDV O型、A型和AsiaⅠ型等优点，能满足临床鉴别检测的需求。

关键词：口蹄疫病毒三重实时荧光定量RT-PCR 应用

猪流行性腹泻病毒N蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及单克隆抗体制备

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中国动物传染病学报 2023年

作者：柴茂马震原杨海波王淑娟刘影王东方赵雪丽王翠谢彩华王华俊闫若潜河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室

利用昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白，并制备单克隆抗体。构建PEDV N基因重组穿梭质粒pFastBac-N，转化至感受态细胞DH10Bac中获取重组杆粒Bacmid-N，将Bacmid-N转染至SF9昆虫细胞中制备重组蛋白。将重组... 详细信息

利用昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白，并制备单克隆抗体。构建PEDV N基因重组穿梭质粒pFastBac-N，转化至感受态细胞DH10Bac中获取重组杆粒Bacmid-N，将Bacmid-N转染至SF9昆虫细胞中制备重组蛋白。将重组蛋白免疫小鼠，经融合、筛选、纯化出单克隆抗体，并测定单克隆抗体相关特性。获得重组杆状病毒rBV-N，获得大小为59 kDa 重组N蛋白(rN)，制备出抗N蛋白单克隆抗体3C8E3，该单抗为IgG1亚类，效价为1∶1.024×105，效价高、特异性强、稳定性好，更具实用性。本研究为PEDV 抗原/抗体诊断试剂盒、PEDV亚单位疫苗研究奠定了基础。

关键词：昆虫杆状病毒表达系统猪流行腹泻病毒单克隆抗体

智慧城市建设对经济高质量发展的影响研究——基于城市韧性视角的分析

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华东经济管理 2024年第3期38卷 47-57页

作者：马震西安财经大学商学院陕西西安710100

智慧城市建设被众多地方政府定位成完成产业结构升级、引领区域经济高质量发展的引擎。文章选取2004—2021年我国237个地级市的数据样本,通过使用准自然实验方法对智慧城市建设与城市经济高质量发展的关系进行了深入研究。结果表明:智... 详细信息

智慧城市建设被众多地方政府定位成完成产业结构升级、引领区域经济高质量发展的引擎。文章选取2004—2021年我国237个地级市的数据样本,通过使用准自然实验方法对智慧城市建设与城市经济高质量发展的关系进行了深入研究。结果表明:智慧城市建设主要是通过提升城市韧性水平来实现城市经济高质量发展溢出效应,其溢出效应在我国东部和中部地区相对显著,且人口规模较大城市的溢出效应显著程度更高。因此,合理扩大智慧城市试点范围,并根据不同地区特点,制定适宜的城市智慧网络体系规划,对于增强城市韧性、预防系统性风险,进而促进城市经济高质量发展等都具有重要意义。

关键词：智慧城市高质量发展城市韧性区域异质性经济溢出效应

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猪伪狂犬病病毒gB抗体竞争酶联免疫检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2023年

作者：刘梅芬马震原王淑娟闫若潜班付国赵雪丽谢彩华王东方柴茂刘影杨海波王翠河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室

为建立猪伪狂犬病病毒gB抗体竞争酶联免疫检测方法，以大肠杆菌表达并纯化的gB 蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗gB蛋白单克隆抗体为酶标抗体，经各反应条件的优化，成功建立了PRV gB抗体的竞争酶联免疫检测方法，并对... 详细信息

为建立猪伪狂犬病病毒gB抗体竞争酶联免疫检测方法，以大肠杆菌表达并纯化的gB 蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗gB蛋白单克隆抗体为酶标抗体，经各反应条件的优化，成功建立了PRV gB抗体的竞争酶联免疫检测方法，并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。PRV gB抗体竞争酶联免疫检测方法经优化后的最佳条件为：gB 蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/mL、包被量100μL/孔，酶标抗体的最佳稀释浓度为1:1000，样品检测时间为30 min（抗原抗体反应）+ 15 min（底物显色）；敏感性结果显示，PRV gB标准阳性血清（Z89）经1:512稀释后经检测仍为阳性；特异性结果显示，猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、大肠杆菌抗体阳性血清的检测结果均为阴性；批内、批间重复试验结果显示，批内、批间变异系数分别为0.24%～9.45%、0.58%～11.61%，均小于12%。通过对采集的184份临床血清检测结果进行比较，该方法与商品化试剂盒的阳性符合率为96.23%，阴性符合率为96.95%，总符合率96.74%。本研究在国内首次建立PRV gB竞争酶联免疫检测方法，为PRV gB抗体快速检测提供了可靠的技术手段。

关键词：猪伪狂犬病病毒 gB蛋白竞争酶联免疫

A型塞内卡病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

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中国动物传染病学报 2023年第2期31卷 133-139页

作者：柴茂马震原王淑娟赵雪丽刘影王东方杨海波谢彩华王翠王华俊闫若潜河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008

为建立基于VP2蛋白、VP3蛋白检测猪塞内卡病毒A(SVA)抗体血清学方法。本研究扩增SVA VP2基因和VP3基因(VP23基因),基因全长1569 bp,并与原核表达载体pGEX-6p-1构建重组载体,IPTG诱导表达可溶性rVP23蛋白,经蛋白酶切除标签蛋白得到sVP23... 详细信息

为建立基于VP2蛋白、VP3蛋白检测猪塞内卡病毒A(SVA)抗体血清学方法。本研究扩增SVA VP2基因和VP3基因(VP23基因),基因全长1569 bp,并与原核表达载体pGEX-6p-1构建重组载体,IPTG诱导表达可溶性rVP23蛋白,经蛋白酶切除标签蛋白得到sVP23蛋白,分子量约为58 kDa。通过矩阵优化、确定临界值、敏感性分析、特异性鉴定,建立了SVA抗体间接ELISA方法。该方法的S/P临界值标准为0.35,批内批间变异系数均小于7%,与中和试验结果符合率为95.49%。上述结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。

关键词：塞内卡病毒 VP23基因间接ELISA方法血清学

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