检索结果-南通市图书馆

遗传 2024年第6期46卷 466-477页

作者：马宝霞杨森吕明王昱人常立业韩艺帆王建刚郭杨徐坤西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100 新疆维吾尔自治区畜牧总站乌鲁木齐830002

在哺乳动物细胞中进行基因敲入通常采用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)机制将外源DNA模板整合到目标基因组靶点中。然而HDR效率往往较低,其中外源DNA模板与目标基因组靶点的共定位是关键限制因素之一。为提高CRISPR/Cas9... 详细信息

在哺乳动物细胞中进行基因敲入通常采用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)机制将外源DNA模板整合到目标基因组靶点中。然而HDR效率往往较低,其中外源DNA模板与目标基因组靶点的共定位是关键限制因素之一。为提高CRISPR/Cas9系统介导的HDR效率,本团队及前人研究将不同接头蛋白与SpCas9蛋白融合表达,利用其与特异性DNA序列结合的特性,构建了多种CRISPR/SpCas9供体适配基因编辑系统。为了便于比较、优化不同CRISPR/Cas9供体适配系统,本研究利用这些系统在HEK293T细胞GAPDH和ACTB基因末位外显子3′-端进行了eGFP基因敲入,并采用了优化的供体DNA模板设计方式,通过PCR和Sanger测序检测敲入的准确性,流式细胞分析进行敲入效率的检测。结果表明,将yGal4BD、hGal4BD、hLacI、hTHAP11和N57等接头蛋白与SpCas9蛋白C-端融合对其活性均无显著性影响;在GAPDH位点上,SpCas9融合yGal4BD、hGal4BD、hLacI和hTHAP11的供体适配系统等均能显著提高敲入效率;在ACTB位点上,SpCas9融合yGal4BD和hGal4BD能显著提高敲入效率;且增加供体DNA模板中的结合序列(binding sequence,BS)数量,有利于提高SpCas9-hTHAP11系统介导的敲入效率。总之,本研究比较并优化了不同的CRISPR/Cas9供体适配基因编辑系统,为后续相关的基因编辑应用研究提供了参考和借鉴。

关键词：基因编辑基因敲入 CRISPR/Cas9 供体适配同源定向修复

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一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

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生物工程学报 2023年第10期39卷 4204-4218页

作者：马宝霞崔婕妤钱泓润张潇筠杨森张骐镜韩艺帆张智英王建刚徐坤西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高... 详细信息

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的SpCas9和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统(donor adapting system,DAS)。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复(homology-directed repair,HDR)效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacIDAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。

关键词：基因编辑 CRISPR/Cas9 LacI基因 LacO序列供体适配

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