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人源抗-HBs Fab表达系统的转换与制备研究

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人源抗-HBs Fab表达系统的转换与制备研究

作者：陆慧琦第二军医大学

学位级别：硕士

随着重组抗体技术的发展，人鼠嵌合抗体、人源化抗体在临床的使用已初显成效。治疗用抗体的核心问题是抗体蛋白的完全人源化，以消除用于人体时产生的HAMA反应或其他并发症，而完全的人源抗体完全避免了鼠源成分，是未来临床应用的必要... 详细信息

随着重组抗体技术的发展，人鼠嵌合抗体、人源化抗体在临床的使用已初显成效。治疗用抗体的核心问题是抗体蛋白的完全人源化，以消除用于人体时产生的HAMA反应或其他并发症，而完全的人源抗体完全避免了鼠源成分，是未来临床应用的必要形式。人源抗体得以有效应用的关键在于其低免疫原性以及保留了对抗原的特异性结合的生物学特性，正成为当前研究的热点。以噬菌体表面呈现技术制备抗体片段，如Fabs或单链Fv，是1990年由McCafferty等最先报道的。通常利用各种噬菌体载体、基因融合技术，连同PCR扩增技术，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库，是近年来形成的最新方法，从而回避了杂交瘤技术和免疫。人源抗体制备的瓶颈是获得高表达、高产量、高活性抗体。前期的研究表明，以pComb3为载体的抗体片段表达无法避免较高的基础表达，难以达到上述的理想制备。本课题引入了一个新的策略，即以pBAD/gⅢ为载体重新克隆抗—HBs Fab基因。这个系统的主要特点在于①在无诱导剂的条件下，表达水平很低，②存在诱导剂的情况下，获得适度地高表达水平，③调节表达地诱导剂浓度范围很宽，④表达系统控制严格。故通过改变诱导方式与表达条件，提升原核表达人源抗体片段的经济性与实用性。另一方面，培养和诱导表达的条件对重组蛋白的纯化有很大的影响。洗涤液的最适盐浓度和咪唑浓度对不同的蛋白有轻微的差异，必须加以确定。本课题共分两个部分：一、人源生物工程抗—HBsFab的克隆与表达以pComb3/anti-HBsFab菌株的质粒为模板，根据pBAD载体的要求与Fab基因结构分别设计引物，分别扩增Fd与λ轻链。依据Fd与λ轻链两端所引入的特异性酶切位点，以相同的内切酶分别酶切载体，分别以连接酶与相应的Fd与入轻链片段连接，构建pBAD-Fd和pBAD-Lc单链抗体片段表达载体。连接产物转化Top10细菌后，经PCR法或酶切鉴定，筛选目的单链抗体片段基因阳性克隆，形成pBAD单肽表达模式。设计特异引物，以基因扩增方式制备包含λ轻链抗体片段基因和启动子、引导序列的核苷酸序列。双酶切已克隆有抗体第二军医大学硕士学位论文中文摘要片段基因PBAD干d载体及上述扩增制备的核着酸序列，以连接酶连接。连接产物转化T叩细菌后，增菌，经测序和酶切鉴定，筛选阳性克隆，琼脂糖电泳证实Fab基因的正确插入。增菌培养所选克隆，在阿拉伯糖诱导条件下表达融合蛋白，进行双启动表达试验，验证双肽同步表达的可行性。筛选阳性菌株进行人源抗体片段的批量制备。挑取正确插入的单克隆转化菌落，于100ml含AmP＊叭）的LB培养基中生长，至OD。。为 1．0时，加入终浓度为 0．02％ara3inose，37℃诱导表达 6 小时，表达上清浓缩至5ml，行12％的SDS－PAGE并转印至硝酸纤维素膜，经封闭后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人laG Fab结合，于50Kd处可见明显蛋白区带，证实该区带确为Fab，HBsAg特异blot结果表明表达产物具有较好的抗原结合活性。比较原pComb3表达系统，改变后的pBAD表达系统明显提高了抗一HBsFab 的表达量并保持了原有抗体活性。二、人源性抗叫BsPab下BAD伯m表达和纯化条件的优化 l．人源性抗一HBsFab－＂BAD／sill表达条件的选择原核表达己克隆的pBAD一抗HBsFab，分别比较不同的菌体密度（OD。。二0．7， OD。二1．0，OD。＝1．2）、诱导剂（阿拉伯糖）终浓度（0．002％，0．02％，0．2％）及诱导时间（4h，6h）对表达的影响。三组变量经统计学分析无显著差异（P＞0．05）。从实验数据的直观分析，在本实验所设定的三组参数，以OD。＝1．0，阿拉伯糖终浓度为0．02％，诱导表达 6h的表达产物吸光度值最佳。 SDS－PAGE电泳和免疫印迹结果显示，与用噬菌体载体pComb3表达的抗一HBsFab相比，具有相同的抗原结合活性。 2．优化应用Ni－NTA柱亲和纯化人源抗HBsFab抗体片段 pBAD一抗HBs重组蛋白通过结合的His标签，应用Ni－NTA金属资合柱纯化，以阿拉伯糖诱导表达制备出抗叫BsFab上清。该融合蛋白带有6 X His标签，利用多聚组氨酸与过渡态金属离子的高亲和力性质，经镍亲和层析柱州 i个TA）对表达产物进行纯化。分别应用含不同浓度咪哩和不同浓度盐的洗涤液洗柱，最后用一定浓度咪哇的洗脱液洗脱目的蛋白，通过

关键词：抗-HBsFab pBAD载体蛋白的原核表达 Ni-NTA亲和纯化抗体活性

中国汉族人IgE重链恒定区CH_2-CH_4cDNA的克隆

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第二军医大学学报 2006年第10期27卷 1158-1159页

作者：唐昊陆慧琦韩焕兴修清玉第二军医大学长征医院呼吸内科上海200003 长征医院实验诊断科

人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上的IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)结合则是这些Ⅰ型变态反应的关键步骤。[第一段]

关键词：免疫球蛋白E 重链恒定区基因克隆质粒构建

运用实时荧光定量RT-PCR法检测乳腺癌组织中ERα、PR和Her2mR-NA表达

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第二军医大学学报 2013年第4期34卷 453-457页

作者：陆慧琦何金陈佳徐毅祝丽双韩焕兴第二军医大学长征医院转化医学中心上海200003 第二军医大学长征医院病理科上海200003

目的评价实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)在测定乳腺癌组织中雌激素受体α(ERα)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her2)基因表达的临床价值。方法选择2010年3月至10月在我院接受手术治疗的乳腺癌患者48例和乳腺良性病变患者28例,用... 详细信息

目的评价实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)在测定乳腺癌组织中雌激素受体α(ERα)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her2)基因表达的临床价值。方法选择2010年3月至10月在我院接受手术治疗的乳腺癌患者48例和乳腺良性病变患者28例,用免疫组化染色(IHC)法检测乳腺癌组织中ERα、PR、Her2蛋白的表达,用实时qRT-PCR法检测乳腺癌组织及良性乳腺肿瘤组织中ERα、PR、Her2mRNA的表达,并评价这两种检测方法在乳腺癌诊断中的价值。结果用实时qRT-PCR测得的ERα、Her2mRNA在乳腺癌组织中的表达均高于对照组织(P<0.05,P<0.01),而PRmRNA的表达在乳腺癌组织与对照组织之间差异无统计学意义。乳腺癌组织中ERα、PR、Her2的蛋白表达与临床TNM分期有关,ERα和PR的阳性表达率随临床TNM分期的升高而下降(P<0.05),Her2的阳性表达率随临床TNM分期的升高而升高(P<0.05)。乳腺癌淋巴结转移组乳腺组织中ERα、Her2mRNA表达均高于无淋巴结转移组(P<0.05),而PR mRNA表达与无淋巴结转移组比较差异无统计学意义。实时qRT-PCR检测ERα、PR、Her2mRNA在评价乳腺癌对内分泌治疗的敏感性、特异性以及病理学诊断的符合率均与IHC相符。结论 ERα、PR和Her2是预测乳腺癌内分泌治疗或靶向治疗的重要基因,本研究建立的实时qRT-PCR检测方法可用于ERα、PR和Her2mRNA表达的临床检测和研究。

关键词：乳腺肿瘤雌激素受体α 孕激素受体人表皮生长因子受体2 实时荧光定量RT—PCR 预后

中国汉族人IgE重链恒定区CH_2、CH_3及CH_4亚基cDNA的克隆

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第二军医大学学报 2007年第10期28卷 1146-1148页

作者：唐昊修清玉陆慧琦韩焕兴第二军医大学长征医院呼吸内科上海200003 长征医院实验诊断科

人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上IgE高亲和力受体(FcεRI)的相互作用则是这些I型变态反应的重要调节步骤。很长时问以来,找到抑制它们结合从而治疗过敏性疾病的方法,一直是过... 详细信息

人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上IgE高亲和力受体(FcεRI)的相互作用则是这些I型变态反应的重要调节步骤。很长时问以来,找到抑制它们结合从而治疗过敏性疾病的方法,一直是过敏性疾病研究的重点,所以了解这两个蛋白相互识别的方式以及结合的位点是极为重要的。从已有的研究得知,[第一段]

关键词：免疫球蛋白E 重链恒定区基因克隆质粒构建

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抗体的抗病毒作用

现代免疫学 2009年第5期29卷 426-430页

作者：陆慧琦韩焕兴第二军医大学长征医院实验诊断科上海200003

由抗体介导的中和作用有多种不同的机制:(1)通过凝集病毒,使病毒的结构失稳,抑制病毒对靶细胞的吸附;(2)抑制病毒的类脂膜与宿主细胞膜的融合,抑制无包膜病毒基因组进入宿主细胞;(3)通过IgA作用于细胞内的信号转导途径来抑制病毒核心蛋... 详细信息

由抗体介导的中和作用有多种不同的机制:(1)通过凝集病毒,使病毒的结构失稳,抑制病毒对靶细胞的吸附;(2)抑制病毒的类脂膜与宿主细胞膜的融合,抑制无包膜病毒基因组进入宿主细胞;(3)通过IgA作用于细胞内的信号转导途径来抑制病毒核心蛋白的功能;(4)结合新生病毒,阻碍其芽生或从细胞表面释放。人们对抗体的抗病毒作用的研究历时已久,其介导的中和作用方式纷繁复杂,但一直存在争议,可以肯定的是任何一种病毒在感染早期都可被特异性抗体以不同的方式中和。在此就抗体介导的中和作用作一概述。

关键词：抗体病毒中和作用凝集作用

重组人血管内皮抑素诱导大鼠心肌细胞凋亡的体内实验研究

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解放军医学杂志 2014年第1期39卷 5-10页

作者：覃晶钱新宇陆慧琦韩焕兴罗荣城浙江省肿瘤医院化疗科杭州310022 杭州市第一人民医院肿瘤内科杭州310006 第二军医大学长征医院实验诊断科上海200003 广州南方医科大学南方医院肿瘤科 510515

目的探讨重组人血管内皮抑素(rh-ES)对大鼠心肌的毒性作用及其可能机制。方法 24只成年雌性Wistar大鼠随机分为rh-ES低、中、高剂量组[分别予3、6、12mg/(kg·d)rh-ES腹腔注射]及对照组(腹腔注射等体积生理盐水),每组6只。各组在第4周和... 详细信息

目的探讨重组人血管内皮抑素(rh-ES)对大鼠心肌的毒性作用及其可能机制。方法 24只成年雌性Wistar大鼠随机分为rh-ES低、中、高剂量组[分别予3、6、12mg/(kg·d)rh-ES腹腔注射]及对照组(腹腔注射等体积生理盐水),每组6只。各组在第4周和第8周末次给药后采用脊椎脱臼法分别处死3只大鼠,在光镜及电镜下观察病理形态学及超微结构改变,TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡情况,CD34标记内皮细胞免疫组化法检测大鼠心肌组织的微血管密度(MVD)改变。结果光镜及电镜下对照组和低、中剂量组无明显心肌损伤的病理形态及超微结构改变。高剂量组光镜下可见心肌损伤的病理形态及超微结构改变。TUNEL法检测显示,给药8周后中剂量组和高剂量组凋亡指数明显高于对照组,差异有统计学意义(P=0.033、P=0.000),其中高剂量组凋亡指数最高。心肌组织微血管计数提示,给药4周及8周后高剂量组(MVD)增加,显著高于对照组(P<0.05)。结论 rh-ES对大鼠心肌细胞具有毒性作用,细胞凋亡机制参与了心肌损伤的病理过程。

关键词：血管内皮抑素心脏毒性细胞凋亡

前列腺特异性抗原（PSA）的ABC－ELISA建立和临床初步应用

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中国免疫学杂志 1994年第3期10卷 152-154页

作者：陆慧琦安晓勇沈新义第二军医大学长征医院实验诊断科

前列腺特异性抗原是从人精液中提取的一种糖蛋白。血清中ＰＳＡ测定对前列腺良、恶性疾病有重要诊断价值。利用生物素─—抗生物素系统与ＥＬＩＳＡ技术相结合，建立了测定血清中ＰＳＡ含量的ＡＢＣ－ＥＬＩＳＡ竞争法。此法较常规的Ｅ... 详细信息

前列腺特异性抗原是从人精液中提取的一种糖蛋白。血清中ＰＳＡ测定对前列腺良、恶性疾病有重要诊断价值。利用生物素─—抗生物素系统与ＥＬＩＳＡ技术相结合，建立了测定血清中ＰＳＡ含量的ＡＢＣ－ＥＬＩＳＡ竞争法。此法较常规的ＥＬＩＳＡ敏感度高，较放免法安全、经济。本文对其方法的灵敏度、重复性、可靠性进行了探讨。测得正常男性血清ＰＳＡ范围是０～３．３ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝８６），女性血清ＰＳＡ未测出（ｎ＝１５）。

关键词：前列腺特异性抗原免疫测定

类风湿关节炎患者血清趋化因子MCP-1、MIP-1α的表达

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第二军医大学学报 2006年第11期27卷 1226-1228页

作者：包军陆慧琦徐沪济第二军医大学长征医院风湿免疫科上海200003

目的：探讨单核细胞化学趋化蛋白1（MCP-1）、巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP1α）在类风湿关节炎（RA）发病中的可能机制。方法：收集年龄为18～79岁的早期RA活动期患者17例，非早期RA活动期患者18例，以及正常健康者15例，评估握力、关节... 详细信息

目的：探讨单核细胞化学趋化蛋白1（MCP-1）、巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP1α）在类风湿关节炎（RA）发病中的可能机制。方法：收集年龄为18～79岁的早期RA活动期患者17例，非早期RA活动期患者18例，以及正常健康者15例，评估握力、关节疼痛指数和肿胀指数等临床活动指数，测定红细胞沉降率、C反应蛋白、类风湿因子等血清学指标，应用ELISA法测定各自血清MCP-1、MIP—1α水平。Kruskal—Wallis法比较各组间MCP-1、MIP1α水平的差异；应用直线相关分析法对血清MCP1、MIP—1α水平与临床活动指数及血清学指标作相关性分析。结果：早期RA、非早期RA血清MCP-1表达均较正常对照组明显升高（P均〈0．01），早期组与非早期组间无明显差异。早期RA的血清MIP1α表达较非早期RA、正常对照组明显升高（P〈0．01），非早期组与对照组间无明显差异。RA患者的血清MCP-1、MIP-1α水平以及早期RA患者的血清M1P-1α水平与疾病临床活动指数以及血清学指标均无明显相关。结论：MCP-1、MIP1α与RA的发生、发展有关；MIP-1α可能在RA早期滑膜炎的发生机制中起了重要作用；未发现RA患者的血清MCP1、MIP-1α表达与炎症活动相关。

关键词：关节炎类风湿单核细胞化学趋化蛋白1 巨噬细胞炎症蛋白1α

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应用综合实验诊断M蛋白病

中国免疫学杂志 2000年第7期16卷 387-389页

作者：陆慧琦屠小卿徐玲玲王皓孔宪涛第二军医大学附属长征医院临床免疫中心上海200003

目的：应用免疫固定的电泳技术，提高M蛋白病的正确诊断率。方法：通过对血清免疫球蛋白定量、区带电泳、固定电泳以及尿的区带电泳、免疫电泳和本周氏蛋白的检测，综合分析判断。结果：检测来自国内送诊的1213例标本，共检出M蛋白445... 详细信息

目的：应用免疫固定的电泳技术，提高M蛋白病的正确诊断率。方法：通过对血清免疫球蛋白定量、区带电泳、固定电泳以及尿的区带电泳、免疫电泳和本周氏蛋白的检测，综合分析判断。结果：检测来自国内送诊的1213例标本，共检出M蛋白445例，占36．69％，准确率达99．6％。结论：以免疫固定电泳替代传统的检测方法，使得鉴定M蛋白的方法较2年前有了更大的提高。

关键词： M蛋白病免疫固定电泳游离轻链诊断