人源抗-HBs Fab表达系统的转换与制备研究
作者单位：第二军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：韩焕兴
授予年度：2003年
学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学]
主 题：抗-HBsFab pBAD载体 蛋白的原核表达 Ni-NTA亲和纯化 抗体活性
摘 要：随着重组抗体技术的发展，人鼠嵌合抗体、人源化抗体在临床的使用已初显成效。治疗用抗体的核心问题是抗体蛋白的完全人源化，以消除用于人体时产生的HAMA反应或其他并发症，而完全的人源抗体完全避免了鼠源成分，是未来临床应用的必要形式。人源抗体得以有效应用的关键在于其低免疫原性以及保留了对抗原的特异性结合的生物学特性，正成为当前研究的热点。 以噬菌体表面呈现技术制备抗体片段，如Fabs或单链Fv，是1990年由McCafferty等最先报道的。通常利用各种噬菌体载体、基因融合技术，连同PCR扩增技术，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库，是近年来形成的最新方法，从而回避了杂交瘤技术和免疫。 人源抗体制备的瓶颈是获得高表达、高产量、高活性抗体。前期的研究表明，以pComb3为载体的抗体片段表达无法避免较高的基础表达，难以达到上述的理想制备。本课题引入了一个新的策略，即以pBAD/gⅢ为载体重新克隆抗—HBs Fab基因。这个系统的主要特点在于①在无诱导剂的条件下，表达水平很低，②存在诱导剂的情况下，获得适度地高表达水平，③调节表达地诱导剂浓度范围很宽，④表达系统控制严格。故通过改变诱导方式与表达条件，提升原核表达人源抗体片段的经济性与实用性。 另一方面，培养和诱导表达的条件对重组蛋白的纯化有很大的影响。洗涤液的最适盐浓度和咪唑浓度对不同的蛋白有轻微的差异，必须加以确定。 本课题共分两个部分： 一、人源生物工程抗—HBsFab的克隆与表达 以pComb3/anti-HBsFab菌株的质粒为模板，根据pBAD载体的要求与Fab基因结构分别设计引物，分别扩增Fd与λ轻链。依据Fd与λ轻链两端所引入的特异性酶切位点，以相同的内切酶分别酶切载体，分别以连接酶与相应的Fd与入轻链片段连接，构建pBAD-Fd和pBAD-Lc单链抗体片段表达载体。连接产物转化Top10细菌后，经PCR法或酶切鉴定，筛选目的单链抗体片段基因阳性克隆，形成pBAD单肽表达模式。设计特异引物，以基因扩增方式制备包含λ轻链抗体片段基因和启动子、引导序列的核苷酸序列。双酶切已克隆有抗体 第二军医大学 硕士学位论文 中文摘要 片段基因PBAD干d载体及上述扩增制备的核着酸序列，以连接酶连接。连接产 物转化T叩 细菌后，增菌，经测序和酶切鉴定，筛选阳性克隆，琼脂糖电泳 证实Fab基因的正确插入。增菌培养所选克隆，在阿拉伯糖诱导条件下表达 融合蛋白，进行双启动表达试验，验证双肽同步表达的可行性。筛选阳性菌株 进行人源抗体片段的批量制备。 挑取正确插入的单克隆转化菌落，于100ml含AmP＊ 叭）的LB培养基 中生长，至OD。。为 1．0时，加入终浓度为 0．02％ara3inose，37℃诱导表达 6 小时，表达上清浓缩至5ml，行12％的SDS－PAGE并转印至硝酸纤维素膜，经封 闭后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人laG Fab结合，于50Kd处可见明显蛋白 区带，证实该区带确为Fab，HBsAg特异blot结果表明表达产物具有较好的 抗原结合活性。 比较原pComb3表达系统，改变后的pBAD表达系统明显提高了抗一HBsFab 的表达量并保持了原有抗体活性。 二、人源性抗叫BsPab下BAD伯m表达和纯化条件的优化 l．人源性抗一HBsFab－＂BAD／sill表达条件的选择 原核表达己克隆的pBAD一抗HBsFab，分别比较不同的菌体密度（OD。。二0．7， OD。二1．0，OD。＝1．2）、诱导剂（阿拉伯糖）终浓度（0．002％，0．02％，0．2％）及诱 导时间（4h，6h）对表达的影响。 三组变量经统计学分析无显著差异（P0．05）。从实验数据的直观分析，在 本实验所设定的三组参数，以OD。＝1．0，阿拉伯糖终浓度为0．02％，诱导表达 6h的表达产物吸光度值最佳。 SDS－PAGE电泳和免疫印迹结果显示，与用噬菌体载体pComb3表达的抗 一HBsFab相比，具有相同的抗原结合活性。 2．优化应用Ni－NTA柱亲和纯化人源抗HBsFab抗体片段 pBAD一抗HBs重组蛋白通过结合的His标签，应用Ni－NTA金属资合柱纯化， 以阿拉伯糖诱导表达制备出抗叫BsFab上清。该融合蛋白带有6 X His标签， 利用多聚组氨酸与过渡态金属离子的高亲和力性质，经镍亲和层析柱州 i个TA） 对表达产物进行纯化。分别应用含不同浓度咪哩和不同浓度盐的洗涤液洗柱， 最后用一定浓度咪哇的洗脱液洗脱目的蛋白，通过
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