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鸭坦布苏病毒分离鉴定和铁蛋白重组囊膜蛋白纳米颗粒的制备及免疫学评价

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鸭坦布苏病毒分离鉴定和铁蛋白重组囊膜蛋白纳米颗粒的制备及免疫...

作者：阴雅洁河北农业大学

学位级别：硕士

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)导致的鸭传染性疾病。该病毒可导致鸭产蛋量减少、卵巢出血、产生神经症状。鸭群感染DTMUV后生长缓慢甚至停滞,饲料转化率降低,且鸭群抵抗力下降,使鸭群更易与一些细菌性疾病... 详细信息

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)导致的鸭传染性疾病。该病毒可导致鸭产蛋量减少、卵巢出血、产生神经症状。鸭群感染DTMUV后生长缓慢甚至停滞,饲料转化率降低,且鸭群抵抗力下降,使鸭群更易与一些细菌性疾病发生混合感染,死亡率大大增加,严重危害了我国水禽养殖业。同时,该病毒可在哺乳动物细胞系中良好复制,且有报道养殖场工作人员检出阳性抗体,说明DTMUV可能对公共安全构成潜在威胁。为了更有效防控该病的流行,本研究从发病鸭场分离鸭坦布苏病毒并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析,同时制备重组囊膜蛋白纳米颗粒并进行免疫学评价,旨在了解并掌握鸭坦布苏病毒流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病原分离,用RT-PCR鉴定、透射电镜观察、Western blot及免疫荧光等方法鉴定病毒,测定病毒毒力后进行动物回归实验和囊膜蛋白遗传进化分析。分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30 nm-60 nm的病毒粒子;RT-PCR鉴定、Western blot及免疫荧光结果均表明,病毒呈DTMUV阳性;将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌肉注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远,并且与商品灭活疫苗毒株HB20]、0株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比第93、第277位和487位已经发生了氨基酸位点的突变。成功分离到一株鸭坦布苏病毒AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。选择鸭坦布苏病毒主要免疫原区域E3蛋白序列通过柔性Linker串联具有自我折叠功能的铁蛋白,密码子优化后克隆至pBV220载体上(pBV220-E3-Fe)。同时,构建重组质粒pBV220-E3。转入Transetta(DE3)感受态细胞进行诱导表达。利用分子筛凝胶层析柱和离子交换层析柱纯化两种蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯化情况,电镜观察重组蛋白自我组装情况。然后将E3蛋白及纳米颗粒重组蛋白(E3-Fe)分别免疫北京鸭,经ELISA检测各组抗体效价水平,鸭外周血淋巴细胞增殖实验检测细胞免疫水平,攻毒并记录各免疫组发病死亡数量及临床症状。Western blot鉴定结果表明E3蛋白及E3-Fe蛋白分子量分别为21 kDa、44 kDa,与预期大小一致,电镜结果表明,重组纳米颗粒直径为20 nm,大小均一,说明融合蛋白成功组装到铁蛋白笼状结构外表面。免疫后雏鸭健康状况良好,无明显的临床表现。两组免疫鸭均产生了抗体,但E3-Fe纳米颗粒免疫组的抗体阻断率显著高于E3蛋白免疫组(P阴性对照组的北京鸭症状发生率为100%,死亡率为30%,而免疫组出现临床症状鸭的数量显著减少(P<0.05),融合蛋白E3-Fe免疫组无死亡情况发生。综合分析各项指标表明成功构建了鸭坦布苏病毒E3蛋白和铁蛋白重组亚单位纳米颗粒,融合铁蛋白有效提高了抗体水平。为以后进一步开发使用纳米颗粒疫苗防治鸭坦布苏病毒病的流行奠定了基础。

关键词：鸭坦布苏病毒分离鉴定遗传进化分析铁蛋白纳米颗粒抗原

基于重构NDRV σC 蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

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中国兽医学报 2022年第8期42卷 1557-1563页

作者：武华林伟东孟利佳阴雅洁乔思娜倪维玲侯绍华徐倩倩董世山河北农业大学动物医学院河北保定071001 上海交通大学医学院上海200025 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 河北创安生物科技有限公司河北保定071001 农业部动物疫病病原生物学华北科学观测实验站河北保定071001

旨在建立灵敏快速诊断新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)抗体的间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)方法,为水禽养殖业提供科学有效的检测手段。先前报道σC蛋白为沉淀表达,因此本研究利用大肠杆菌的密码子偏嗜性等规律优化其... 详细信息

旨在建立灵敏快速诊断新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)抗体的间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)方法,为水禽养殖业提供科学有效的检测手段。先前报道σC蛋白为沉淀表达,因此本研究利用大肠杆菌的密码子偏嗜性等规律优化其基因序列进行原核表达,纯化出高纯度的可溶性σC蛋白。采用方阵滴定法确定σC蛋白包被浓度和样品稀释度,初步建立NDRV的iELISA检测方法。分别对84份阳性和180份阴性质控血清进行分析,构建受试者工作特征曲线(ROC),通过Youden指数选择灵敏性和特异性最佳的P值作为阴阳临界值。使用质控阴、阳血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究的和实验室先前建立的全病毒包被的iELISA方法同时对质控血清进行检测,比较其符合率。通过方阵滴定法确定各组分条件为σC蛋白包被质量浓度0.5μg/孔、血清稀释度1∶320。构建的ROC曲线下面积为1.00,最佳阴阳临界值为0.076,在此临界值上的灵敏性和特异性均为100%。全病毒包被板和σC蛋白包被板符合率为100%,但前者检测样品的D_(450)值偏低,σC蛋白包被板则弥补了这一缺点。本研究为NDRV提供特异性和灵敏性良好的iELISA抗体检测方法。

关键词：新型鸭呼肠孤病毒原核表达 σC蛋白间接ELISA方法

经分子佐剂诱导产生的卵黄抗体对NDRV的预防和治疗效力评价

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中国兽医科学 2022年第1期52卷 128-134页

作者：武华孟利佳阴雅洁乔思娜倪维玲陈立功侯绍华徐倩倩董世山河北农业大学动物医学院河北保定071001 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 农业部动物疫病病原生物学华北科学观测实验站河北保定071001 河北创安生物科技有限公司河北保定071001

为了预防和应对新型鸭呼肠孤病毒引起的综合疾病,本研究利用分离到的新型鸭呼肠孤病毒,制备了具有良好中和活性的高效价IgY。中和试验结果显示:三免后第14天抗体滴度达到峰值,而后趋于平稳(>26),且添加CpG和IL-2分子佐剂的组别提取的Ig... 详细信息

为了预防和应对新型鸭呼肠孤病毒引起的综合疾病,本研究利用分离到的新型鸭呼肠孤病毒,制备了具有良好中和活性的高效价IgY。中和试验结果显示:三免后第14天抗体滴度达到峰值,而后趋于平稳(>26),且添加CpG和IL-2分子佐剂的组别提取的IgY比未添加分子佐剂的组别中和滴度提高约3倍;将抗体注入SPF鸡胚进行攻毒保护试验,结果显示中和组的保护率最高,预防组的略高于治疗组的,且CpG组所提取的IgY预防效果(83%)和治疗效果(75%)最佳。本研究提取的高效价IgY能应用到临床防控中,可有效预防及治疗新型鸭呼肠孤病毒病。

关键词：新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体 IL-2 CpG 中和抗体

鸭坦布苏病毒分离鉴定及其囊膜蛋白遗传进化分析

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中国畜牧兽医 2022年第4期49卷 1497-1506页

作者：阴雅洁梁瑞英崔欢孟利佳倪维玲乔思娜郭康康张博李松励侯绍华董世山河北农业大学动物医学院保定071000 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

【目的】了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电... 详细信息

【目的】了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。

关键词：鸭坦布苏病毒(DTMUV) 分离鉴定囊膜蛋白遗传进化分析

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“六快”措施确保优质棉花车车入库 A03

人民铁道

作者：左鹏阴雅洁

本报西安6月15日电（通讯员左鹏阴雅洁）日前，受国家惠农政策影响，大量新疆优质棉花呈 “井喷”态势，集中到达全国棉纺织产品重要生产基地的陕西省咸阳市。　　　　西安西站管内咸阳站为确保棉花卸车安全，积极采取 “快运送、快...

本报西安6月15日电（通讯员左鹏阴雅洁）日前，受国家惠农政策影响，大量新疆优质棉花呈 “井喷”态势，集中到达全国棉纺织产品重要生产基地的陕西省咸阳市。　　　　西安西站管内咸阳站为确保棉花卸车安全，积极采取 “快运送、快卸车、快组织、快通知、快交付、快排空”

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秦都盛开民族和谐“格桑花” 009

新型鸭呼肠孤病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

科技日报

作者：史俊斌左鹏阴雅洁

咸阳车站位于千古秦都古咸阳境内，隔陇海铁路正线与雪域高原“格桑花”之称的西藏民族学院遥遥相望。多年来，咸阳站300多名干部职工用辛勤和汗水同西藏民族学院3000多名师生共同谱写了一曲民族和谐的赞歌，浇灌了一朵盛开在千里铁道...

咸阳车站位于千古秦都古咸阳境内，隔陇海铁路正线与雪域高原“格桑花”之称的西藏民族学院遥遥相望。多年来，咸阳站300多名干部职工用辛勤和汗水同西藏民族学院3000多名师生共同谱写了一曲民族和谐的赞歌，浇灌了一朵盛开在千里铁道线上的“格桑花”。　　温馨服务“每

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河北农业大学学报 2020年第5期43卷 80-84页

作者：张博陈立功武华阴雅洁孟利佳郭康康侯绍华董世山河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

为了快速、准确检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV),本试验采用NDRVσB基因的序列保守区,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了NDRV实时荧光定量RT-PCR检测方法标准曲线,并进行特异性试验、敏感性试验、重复... 详细信息

为了快速、准确检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV),本试验采用NDRVσB基因的序列保守区,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了NDRV实时荧光定量RT-PCR检测方法标准曲线,并进行特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测试验。结果表明:所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法标准曲线方程为y=-3.354x+44.818,扩增效率为98.7%,标准曲线的相关系数为0.999;该方法可以特异性检测NDRV,但对MDRV、ARV、TMUV、DHAV均无反应信号;该方法检测质粒标准品最低检测浓度为10拷贝/μL,是普通PCR方法检测敏感性的1000倍;该方法的组内与组间变异系数均小于2%;用该方法检测临床样品,结果显示NDRV阳性率为45%,而常规RT-PCR阳性率为33%,比常规RT-PCR敏感。说明本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法可为NDRV的监测和早期诊断提供可靠的技术支撑。

关键词：新型鸭呼肠孤病毒 σB基因荧光定量 RT-PCR TaqMan探针应用

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鸭呼肠孤病毒的分离及其鉴定

鸭呼肠孤病毒的分离及其鉴定

中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十五次学术交流会、中国病理生理学会动物病理学专业委员会第二十四次学术研讨会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会第四次学术研讨会、中国兽医病理学家第四次研讨会

作者：张博郭康康崔欢武华阴雅洁张诚陈立功董世山河北农业大学动物医学院/农业部动物疫病病原生物学华北科学观测实验站

1.目的:对鸭呼肠孤病毒进行分离纯化鉴定。2.材料方法:2.1临床症状及病料采集:鸭群大多呈现精神萎靡不振和食欲减退现象,部分病鸭出现拉黄、绿色稀粪,呼吸啰音、软脚、流泪,眼睑周围羽毛潮湿、个别呈现神经运动功能失调症状,死鸭可见角...

1.目的:对鸭呼肠孤病毒进行分离纯化鉴定。2.材料方法:2.1临床症状及病料采集:鸭群大多呈现精神萎靡不振和食欲减退现象,部分病鸭出现拉黄、绿色稀粪,呼吸啰音、软脚、流泪,眼睑周围羽毛潮湿、个别呈现神经运动功能失调症状,死鸭可见角弓反张现象,并采集心、肝、脾、肺、肾等脏器。2.2病原的分离与纯化:将肝脏和脾脏进行研磨。-70℃反复冻融3次。10000×g离心20 min,吸取上清,0.22n

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来源： cnki会议评论

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猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及其鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及其鉴定