鸭坦布苏病毒分离鉴定和铁蛋白重组囊膜蛋白纳米颗粒的制备及免疫学评价

作     者：阴雅洁 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董世山;侯绍华

授予年度：2021年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸭坦布苏病毒 分离鉴定 遗传进化分析 铁蛋白 纳米颗粒抗原 

摘      要：鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)导致的鸭传染性疾病。该病毒可导致鸭产蛋量减少、卵巢出血、产生神经症状。鸭群感染DTMUV后生长缓慢甚至停滞,饲料转化率降低,且鸭群抵抗力下降,使鸭群更易与一些细菌性疾病发生混合感染,死亡率大大增加,严重危害了我国水禽养殖业。同时,该病毒可在哺乳动物细胞系中良好复制,且有报道养殖场工作人员检出阳性抗体,说明DTMUV可能对公共安全构成潜在威胁。为了更有效防控该病的流行,本研究从发病鸭场分离鸭坦布苏病毒并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析,同时制备重组囊膜蛋白纳米颗粒并进行免疫学评价,旨在了解并掌握鸭坦布苏病毒流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病原分离,用RT-PCR鉴定、透射电镜观察、Western blot及免疫荧光等方法鉴定病毒,测定病毒毒力后进行动物回归实验和囊膜蛋白遗传进化分析。分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30 nm-60 nm的病毒粒子;RT-PCR鉴定、Western blot及免疫荧光结果均表明,病毒呈DTMUV阳性;将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌肉注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远,并且与商品灭活疫苗毒株HB20]、0株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比第93、第277位和487位已经发生了氨基酸位点的突变。成功分离到一株鸭坦布苏病毒AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。选择鸭坦布苏病毒主要免疫原区域E3蛋白序列通过柔性Linker串联具有自我折叠功能的铁蛋白,密码子优化后克隆至pBV220载体上(pBV220-E3-Fe)。同时,构建重组质粒pBV220-E3。转入Transetta(DE3)感受态细胞进行诱导表达。利用分子筛凝胶层析柱和离子交换层析柱纯化两种蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯化情况,电镜观察重组蛋白自我组装情况。然后将E3蛋白及纳米颗粒重组蛋白(E3-Fe)分别免疫北京鸭,经ELISA检测各组抗体效价水平,鸭外周血淋巴细胞增殖实验检测细胞免疫水平,攻毒并记录各免疫组发病死亡数量及临床症状。Western blot鉴定结果表明E3蛋白及E3-Fe蛋白分子量分别为21 kDa、44 kDa,与预期大小一致,电镜结果表明,重组纳米颗粒直径为20 nm,大小均一,说明融合蛋白成功组装到铁蛋白笼状结构外表面。免疫后雏鸭健康状况良好,无明显的临床表现。两组免疫鸭均产生了抗体,但E3-Fe纳米颗粒免疫组的抗体阻断率显著高于E3蛋白免疫组(P0.001),鸭外周血淋巴细胞增殖实验结果表明E3-Fe纳米颗粒效果引起的细胞免疫更佳。攻毒后,阴性对照组的北京鸭症状发生率为100%,死亡率为30%,而免疫组出现临床症状鸭的数量显著减少(P0.05),融合蛋白E3-Fe免疫组无死亡情况发生。综合分析各项指标表明成功构建了鸭坦布苏病毒E3蛋白和铁蛋白重组亚单位纳米颗粒,融合铁蛋白有效提高了抗体水平。为以后进一步开发使用纳米颗粒疫苗防治鸭坦布苏病毒病的流行奠定了基础。