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体内精原干细胞介导法制备抗病转基因鸡

中国畜牧杂志 2011年第19期47卷 1-6页

作者：孙敏施青青阴彦辉傅德智秦玉蓉许峰李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

实验旨在利用精原干细胞介导的方法体内转染融合基因EGFP-MMx,制备抗病毒性疾病转基因鸡。采用脂质体包埋法,睾丸内注射EGFP-MMx融合基因,术后采集30、40、50、60、70、80 d睾丸组织进行冰冻切片、基因组PC R、点杂交实验,转染后60 d公... 详细信息

实验旨在利用精原干细胞介导的方法体内转染融合基因EGFP-MMx,制备抗病毒性疾病转基因鸡。采用脂质体包埋法,睾丸内注射EGFP-MMx融合基因,术后采集30、40、50、60、70、80 d睾丸组织进行冰冻切片、基因组PC R、点杂交实验,转染后60 d公鸡精液人工授精于正常母鸡,对后代血液采用PC R检测技术、R T-PC R和W estern blot方法检测外源基因EGFP-MMx的整合表达情况。结果表明:睾丸基因组点杂交阳性率为72.2%。通过PC R、R T-PCR检测方法,在实验公鸡精液和F1代血液中检测到目的基因,精液阳性率为25%,F1代阳性率为10.53%,Western blot检测F1代阳性率为7.89%。结果证明外源基因通过睾丸注射法可整合到基因组上,为培育抗病转基因鸡提供参考依据。

关键词：精原干细胞 EGFP—MMx融合蛋白转基因鸡

睾丸注射法制备携带山羊H-FABP基因的转基因小鼠

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遗传 2012年第6期34卷 727-735页

作者：阴彦辉孙敏陈庭锋张亚妮朱才业李伟李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室扬州225009

为探究睾丸注射法制备转基因动物的可能性,文章将携带有山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和绿色荧光蛋白标签的重组载体经脂质体包裹后随机打点注射小鼠睾丸。对实验小鼠进行睾丸切片、精子荧光检测以及精子DNA检测,证实外源基因在亲... 详细信息

为探究睾丸注射法制备转基因动物的可能性,文章将携带有山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和绿色荧光蛋白标签的重组载体经脂质体包裹后随机打点注射小鼠睾丸。对实验小鼠进行睾丸切片、精子荧光检测以及精子DNA检测,证实外源基因在亲代小鼠体内成功表达。睾丸注射后小鼠与正常母鼠交配产生的F1代,以及F1代自交产生的F2代在不同水平均可检测到外源基因的成功表达,阳性率分别为4%和30.23%。研究结果说明睾丸注射是一种制备转基因动物行之有效的方法,且外源基因可以稳定遗传。该方法的完善和成熟对于动物转基因以及动物性状改良和育种具有理论和实践意义。

关键词：睾丸注射转基因小鼠心脏型脂肪酸结合蛋白

徐淮山羊PPAR基因cDNA的克隆和生物信息学分析

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江苏农业科学 2011年第2期39卷 59-61页

作者：秦玉蓉许峰田智泉高波张振韬阴彦辉孙敏李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009

为克隆徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体(PPAR)基因的cDNA,探讨徐淮山羊PPAR基因的生物信息学功能。根据GenBank中发表的绵羊PPAR基因序列,设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法克隆徐淮山羊脂肪组织中PPAR基因cDNA,提交GenBank,并运用DNA... 详细信息

为克隆徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体(PPAR)基因的cDNA,探讨徐淮山羊PPAR基因的生物信息学功能。根据GenBank中发表的绵羊PPAR基因序列,设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法克隆徐淮山羊脂肪组织中PPAR基因cDNA,提交GenBank,并运用DNAStar软件及在线工具进行生物信息学分析。成功克隆出徐淮山羊PPAR基因的编码区全序列cDNA,大小为1 428 bp,GenBank登录号为GU082382,有起始密码子ATG和终止密码子TAG,编码475个氨基酸;徐淮山羊PPAR基因序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊相应编码区(CDS)的同源性分别为81%、89%、92%、98%、99%,徐淮山羊PPAR氨基酸序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊的PPAR氨基酸序列同源性分别为92.9%、97.3%、98.3%、99.6%、99.8%;PPAR蛋白无信号肽区域,属于非分泌型蛋白。

关键词：徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体 cDNA 克隆生物信息学

湖羊MyoG基因CDS的克隆及其真核表达载体的构建

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中国畜牧杂志 2011年第9期47卷 24-28页

作者：许峰秦玉蓉阴彦辉张振韬宋正海范广习高波李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 苏州市吴中区东山动物防疫站江苏苏州215128

参阅GenBank发表的波尔山羊肌细胞生成素(MyoG)基因序列,设计3对具有互补末端的特异性引物,分别扩增出湖羊MyoG基因的3个外显子,利用重叠PCR技术,将此3个外显子连接,并构建成重组质粒pcDNA3.0-MyoG,转染NIH-3T3细胞,RT-PCR鉴定。结果表... 详细信息

参阅GenBank发表的波尔山羊肌细胞生成素(MyoG)基因序列,设计3对具有互补末端的特异性引物,分别扩增出湖羊MyoG基因的3个外显子,利用重叠PCR技术,将此3个外显子连接,并构建成重组质粒pcDNA3.0-MyoG,转染NIH-3T3细胞,RT-PCR鉴定。结果表明:成功克隆了湖羊MyoG基因的CDS,在离体细胞中MyoG基因发生了转录,这为进一步研究MyoG基因的体内外表达及生物学的活性奠定了基础。

关键词： MyoG基因重叠PCR 真核表达载体湖羊

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鸡Piwi蛋白的亚细胞定位研究

畜牧兽医学报 2013年第1期44卷 15-22页

作者：戴爱琴常国斌陈蓉张颖阴彦辉马腾李建超陈国宏扬州大学动物科学与技术学院扬州225009

通过构建2种真核表达载体比较Piwi蛋白在真核细胞中的表达部位,为进一步研究Piwi蛋白的生物学功能提供依据。采用RT-PCR方法克隆了狼山鸡睾丸组织中Piwi基因CDS,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-Piwi,... 详细信息

通过构建2种真核表达载体比较Piwi蛋白在真核细胞中的表达部位,为进一步研究Piwi蛋白的生物学功能提供依据。采用RT-PCR方法克隆了狼山鸡睾丸组织中Piwi基因CDS,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-Piwi,脂质体PEI介导基因转染NIH-3T3细胞,同时构建pcDNA3.1-Piwi真核表达载体,采用细胞间接免疫荧光方法检测Piwi蛋白在NIH-3T3细胞的表达部位。结果表明,成功克隆出公鸡Piwi基因的全序列CDS,大小为2 604bp,与GenBank中预计的序列基本一致;融合表达载体pEGFP-C1-Piwi在整个细胞中都有表达;而间接免疫荧光方法检测到pcDNA3.1-Piwi载体主要在NIH-3T3细胞质中表达。Piwi蛋白主要在细胞质中表达,采用间接免疫荧光方法比EGFP报告基因法更为可靠,适合目的蛋白的亚细胞定位研究。

关键词： Piwi蛋白真核表达亚细胞定位绿色荧光蛋白间接免疫荧光

鸡瘦素蛋白输卵管特异性表达载体的构建及其表达的研究

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中国家禽 2010年第21期32卷 27-30页

作者：阴彦辉张振韬高波孙敏许峰秦玉蓉李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009

研究旨在利用生物反应器原理获得大量的、供实验研究的人瘦素蛋白。根据GenBank公布的人瘦素蛋白基因序列(登录号为NM000230)设计一对特异性引物,构建鸡输卵管瘦素特异性表达载体pOV3-OB,将重组质粒采用PEI包裹后翅静脉注射试验用鸡,收... 详细信息

研究旨在利用生物反应器原理获得大量的、供实验研究的人瘦素蛋白。根据GenBank公布的人瘦素蛋白基因序列(登录号为NM000230)设计一对特异性引物,构建鸡输卵管瘦素特异性表达载体pOV3-OB,将重组质粒采用PEI包裹后翅静脉注射试验用鸡,收集蛋清并检测瘦素蛋白表达情况。结果显示:通过Western-blot检测,瘦素蛋白发生特异性表达。人瘦素蛋白可以在鸡输卵管中实现暂态表达,本研究为该蛋白的获取及其生物活性的研究奠定基础。

关键词：瘦素克隆暂态表达生物反应器

鸡胚ESC和SSCs特定基因表达差异的研究

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生物技术 2011年第3期21卷 16-19页

作者：孙敏施青青傅德智阴彦辉张亚妮李碧春江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009 扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009

目的:探讨鸡胚胎干细胞(ESC)和精原干细胞(SSCs)在基因表达水平上的差异。方法:传至二代的ESC和SSCs,采用免疫荧光和碱性磷酸酶检测法联合鉴定其干细胞特性,RT-PCR方法检测两者相关基因的表达差异。结果:两种处于未分化状态时的干细胞... 详细信息

目的:探讨鸡胚胎干细胞(ESC)和精原干细胞(SSCs)在基因表达水平上的差异。方法:传至二代的ESC和SSCs,采用免疫荧光和碱性磷酸酶检测法联合鉴定其干细胞特性,RT-PCR方法检测两者相关基因的表达差异。结果:两种处于未分化状态时的干细胞基因表达存在差异:未分化的ESC表达基因GDF3基因和Nanog基因;SSCs表达特定基因c-kit、Cvh和Stra8基因。结论:两种干细胞在基因表达水平上有差异,为ESC与SSCs在基因水平上的鉴定提供参考依据。

关键词：鸡胚胎干细胞鸡精原干细胞基因表达鉴定

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睾丸注射Mx基因生产抗病转基因鸡初探

扬州大学学报（农业与生命科学版） 2010年第2期31卷 14-18页

作者：孙敏倪黎刚施青青阴彦辉傅德智高波李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 江苏畜牧兽医职业技术学院江苏泰州225300

采用脂质体转染法,将线性化pcDNA3.0-MMx质粒随机打点注射入18周龄青年公鸡睾丸内,术后观察公鸡日常活动、常规检测精子;采集转染后25、50、75 d公鸡精液,并于转染70 d后人工采精,授精于正常母鸡,产生F1后代,采用常规PCR检测技术,检测... 详细信息

采用脂质体转染法,将线性化pcDNA3.0-MMx质粒随机打点注射入18周龄青年公鸡睾丸内,术后观察公鸡日常活动、常规检测精子;采集转染后25、50、75 d公鸡精液,并于转染70 d后人工采精,授精于正常母鸡,产生F1后代,采用常规PCR检测技术,检测证实外源Mx基因的整合情况,探讨外源Mx基因在鸡体内稳定整合和遗传的能力。结果表明:手术法转染外源基因过程对公鸡的生殖功能未造成明显影响;PCR检测证实外源Mx基因已整合到精子基因组,且能通过体外受精传递给后代,后代PCR检测的阳性率为27.27%(6/22)。证明外源Mx基因能稳定整合到基因组上,睾丸内注射法可能是一种切实可行、易于推广的制备抗病转基因鸡的方法。

关键词：睾丸注射法 Mx蛋白转基因鸡

徐淮山羊LPL基因克隆及其表达产物亚细胞定位的研究

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畜牧兽医学报 2011年第6期42卷 772-778页

作者：秦玉蓉许峰田智泉高波张振韬阴彦辉孙敏李碧春扬州大学动物科学与技术学院扬州225009

旨在克隆徐淮山羊脂蛋白酯酶(LPL)基因的cDNA,并通过EGFP融合蛋白实现该基因亚细胞水平的表达定位。本研究通过RT-PCR方法克隆徐淮山羊LPL基因cDNA,并初步进行生物信息学分析,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pE... 详细信息

旨在克隆徐淮山羊脂蛋白酯酶(LPL)基因的cDNA,并通过EGFP融合蛋白实现该基因亚细胞水平的表达定位。本研究通过RT-PCR方法克隆徐淮山羊LPL基因cDNA,并初步进行生物信息学分析,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-LPL。聚乙烯亚胺(PEI)介导pEGFP-C1-LPL转染NIH-3T3细胞,48h后在荧光倒置显微镜下观察,并用RT-PCR方法检测LPLmRNA在细胞内的表达。结果,成功克隆出山羊LPL基因1 530bp长的cDNA,完整阅读框大小为1 437bp,共编码478个氨基酸,GenBank登录号为GU082383。信号肽区域预测结果表明LPL蛋白含有一小段信号肽序列,其可能性为100%。信号肽酶切割位置在第23和24个氨基酸之间,其可能性达到65.9%。成功构建融合表达载体pEGFP-C1-LPL,并且RT-PCR显示转染后LPL在mRNA水平上表达明显。EGFP-LPL融合蛋白定位在NIT-3T3细胞外和细胞膜部分。结果表明,首次成功克隆出徐淮山羊LPL基因cDNA;重组质粒pEGFP-C1-LPL构建成功,并在NIH-3T3细胞中明显表达。

关键词：脂蛋白酯酶基因真核表达 NIH-3T3细胞绿色荧光蛋白