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谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸脱氢酶单突变体酶学性质表征

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食品科学 2023年第18期44卷 110-116页

作者：江泽沅柳羽哲高欣曾琦闵伟红吉林农业大学食品科学与工程学院小麦和玉米深加工国家工程实验室吉林长春130118

通过定点突变技术,提高高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)的催化活性,减少通路中代谢产物对其产生的反馈抑制和阻遏作用。对HSD与底物高丝氨酸分子进行对接,通过其空间结构分析,选择Asp61和Gly25两个关键位点进行定点饱和突... 详细信息

通过定点突变技术,提高高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)的催化活性,减少通路中代谢产物对其产生的反馈抑制和阻遏作用。对HSD与底物高丝氨酸分子进行对接,通过其空间结构分析,选择Asp61和Gly25两个关键位点进行定点饱和突变,通过酶活力筛选,发现突变体A61L和G25G较野生型(wildtype,WT)酶活力显著提高。对这两个突变体进行酶动力学和酶学性质研究,结果显示:相较于WT,A61L和G25G的Km值降低,底物亲和力增强,酶活力分别提高到1.21、1.35倍;n值减小,正协同性增加;A61L和G25G最适温度与WT相同均为40℃;A61L最适pH值与WT相同为8.0,G25G最适pH值为8.5较WT提高;A61L和G25G酶活力半衰期较WT分别延长1h和减少0.5h;低浓度K^(+)、Mg^(2+)、Ca^(2+)对突变体和WT有激活作用;不同体积分数甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜对突变体和WT有明显抑制作用;在1~25mmol/L抑制剂浓度下,突变体受抑制作用较WT明显减弱。本研究获得酶活力提高、别构抑制减弱的突变体G25G和A61L,为优化HSD合成代谢途径和构建高产蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸菌株提供了参考。

关键词：谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸脱氢酶酶学性质定点突变酶动力学

罗耳阿太菌多糖经Nrf2通路预防小鼠肝脏铅损伤机制

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食品工业科技 2022年第20期43卷 395-402页

作者：赵盼李鸿梅王志超闵伟红吉林农业大学食品科学与工程学院吉林长春130118

目的:本研究旨在探究罗耳阿太菌多糖(Athelia rolfsii polysaccharides,AEPS)保护铅暴露小鼠肝脏的作用机制。方法:小鼠随机分为正常组(NC)、模型组(MC)、阳性对照组(PC)、AEPS低剂量组(LD)、AEPS中剂量组(MD)、AEPS高剂量组(HD)、全反... 详细信息

目的:本研究旨在探究罗耳阿太菌多糖(Athelia rolfsii polysaccharides,AEPS)保护铅暴露小鼠肝脏的作用机制。方法:小鼠随机分为正常组(NC)、模型组(MC)、阳性对照组(PC)、AEPS低剂量组(LD)、AEPS中剂量组(MD)、AEPS高剂量组(HD)、全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)单独组(ATRA+NC)、ATRA干预组(ATRA+MC)和ATRA+AEPS高剂量组(ATRA+HD)。测定铅暴露小鼠肝脏的铅含量、抗氧化指标、功能指标,苏木伊红染色评估小鼠肝脏病理切片。测定小鼠肝脏谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-s-transferase,GST)活性和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,肝脏组织中细胞凋亡相关蛋白、多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)及肝细胞核中核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)蛋白水平。结果:AEPS低、中、高剂量组均显著提高铅暴露小鼠肝细胞MRP2运输铅离子的能力(P<0.05),并呈剂量依赖性地减少小鼠肝脏铅积累(P<0.05)。AEPS显著抑制铅暴露小鼠肝细胞凋亡(P<0.05),呈剂量依赖性地增强小鼠肝脏抗氧化能力(P<0.05),恢复肝功能(P<0.05),并减轻肝脏病理损伤。AEPS还促进了Nrf2向肝细胞核转移(P<0.05)。而ATRA干预可降低AEPS对铅暴露小鼠肝脏的保护作用。结论:AEPS依赖于Nrf2信号通路可减少肝脏铅积累,保护肝脏铅损伤。

关键词：罗耳阿太菌多糖(AEPS) 核因子E2相关因子2(Nrf2) 保护机制铅暴露肝脏损伤

北京棒杆菌单体天冬氨酸激酶T379N/A380C/T65I/D173G突变体酶学性质表征及工程菌构建

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食品科学 2022年第2期43卷 100-107页

作者：王亚南刘晓婷樊占青王哲人高欣闵伟红吉林农业大学食品科学与工程学院小麦和玉米深加工国家工程实验室吉林长春130118

选取天冬氨酸激酶抑制剂赖氨酸(Lys)的结合位点苏氨酸(Thr)379和丙氨酸(Ala)380、底物天冬氨酸(Asp)的结合位点Thr65、既是底物也是ATP结合位点的催化活性中心Asp173,对4个关键残基位点进行定点饱和突变。采用高通量筛选方法成功构建突... 详细信息

选取天冬氨酸激酶抑制剂赖氨酸(Lys)的结合位点苏氨酸(Thr)379和丙氨酸(Ala)380、底物天冬氨酸(Asp)的结合位点Thr65、既是底物也是ATP结合位点的催化活性中心Asp173,对4个关键残基位点进行定点饱和突变。采用高通量筛选方法成功构建突变体T379N/A380C/T65I/D173G,与野生型(wild type,WT)相比,酶活力提高到75.83倍。动力学与酶学性质表征显示:相比于WT,K;值由4.11 mmol/L降低至1.34 mmol/L,表明与底物亲和力增强;n值由1.71减小到1.07,正协同性降低。突变体T379N/A380C/T65I/D173G最适反应温度由WT的25℃提高到30℃,最适pH值与WT相同均为8.0,半衰期由WT的4.24 h缩短至3.23 h。突变体在0.2~10 mmol/L抑制剂浓度下,抑制作用整体减弱,尤其在Lys和Lys+Thr作用下明显激活。通过无缝克隆技术电转入北京棒杆菌构建工程菌,发酵测得Lys产量相比WT提高83.05%,Thr提高29.36%,甲硫氨酸(Met)提高30.77%,为优化天冬氨酸激酶代谢途径和构建高产天冬氨酸族氨基酸菌株提供参考。

关键词：北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体酶学性质工程菌构建

谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌生物合成L-甲硫氨酸的代谢工程改造研究进展

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食品科学 2023年第13期44卷 226-234页

作者：柳羽哲江泽沅高欣曾琦王钰盛刘晓婷闵伟红吉林农业大学食品科学与工程学院小麦和玉米深加工国家工程实验室吉林长春130118

L-甲硫氨酸是生命体必需的唯一含硫氨基酸,其作为前体参与合成多种生物活性物质,并参与机体多种代谢,被广泛应用于食品、动物饲料、药品、化妆品等领域。由于L-甲硫氨酸是唯一无法用微生物发酵法工业化生产的必需氨基酸,近年来,利用代... 详细信息

L-甲硫氨酸是生命体必需的唯一含硫氨基酸,其作为前体参与合成多种生物活性物质,并参与机体多种代谢,被广泛应用于食品、动物饲料、药品、化妆品等领域。由于L-甲硫氨酸是唯一无法用微生物发酵法工业化生产的必需氨基酸,近年来,利用代谢工程提升L-甲硫氨酸产量受到国内外研究人员的普遍重视。本文主要分析并比较在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中L-甲硫氨酸的生物合成途径及代谢调控网络机制;分别从解除代谢途径对关键酶的反馈作用、阻断或削弱支路代谢途径、中心代谢调控网络的优化、增强辅助因子的供应以及转运系统的优化这5个方面综述L-甲硫氨酸代谢工程改造策略,总结L-甲硫氨酸的生物合成研究进展并作展望,旨在为L-甲硫氨酸高产发酵菌株的选择提供依据。

关键词： L-甲硫氨酸代谢工程生物合成谷氨酸棒杆菌大肠杆菌