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鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 165-173页

作者：赵雪丽闫若潜王华俊王淑娟马震原谢彩华柴茂杨海波王翠刘影王东方河南省动物疫病预防控制中心、河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性... 详细信息

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

关键词：猪圆环病毒2型 rep基因猪圆环病毒3型 cap基因双重TaqMan MGB FQ-PCR

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重组猪α干扰素/白细胞介素-2的可溶性表达及体外活性研究

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农业生物技术学报 2024年第3期32卷 595-604页

作者：冯桂丹闫若潜马震原柴茂周建浩康台生王淑娟杨海波刘影谢彩华赵雪丽王翠河南农业大学动物医学院上海市动物疫病预防控制中心河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警与防控重点实验室河南科技大学动物科技学院

猪(Sus scrofa) α干扰素/白细胞介素-2 (porcine interferon α/porcine interleukin-2,PoIFN-α-linkerPoIL-2)在大肠杆菌(Escherichia coli)中多以包涵体形式表达，为在大肠杆菌系统中获得可溶性表达的具有活性的重组猪α干扰素/白介素2 (rPoIFN-α-linker-PoIL-2)蛋白，本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因进行可溶性改造并合成。将改造后的PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因克隆到表达载体p ET-32a(+)进行原核表达，采用镍铬亲和层析柱对表达的可溶性rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白进行纯化。分别采用淋巴细胞增殖检测法、ELISA方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白体外促猪外周血T淋巴细胞(peripheral blood T lymphocyte,PBLC)增殖活性，及其与抗猪白介素2单抗、抗猪α干扰素单抗发生特异性免疫反应的活性；采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在不同细胞系上抑制不同病毒的增殖活性。结果显示，PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因可在大肠杆菌中高效可溶性表达，表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白分子量大小约55 k D。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白经镍铬亲和层析柱纯化后纯度达90%以上。rPoIFN-α-linker-PoIL-2具有显著的促PBLC增殖活性(P<0.05)；可以与抗PoIL-2、PoIFN-α单抗发生特异性免疫反应。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在不同细胞上抑制不同病毒的增殖活性效价有差异，在猪肾细胞(porcine kidney cells,PK)-15、人羊膜细胞(human amniotic cells) WISH上抑制水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)增殖的活性单位分别为1.8×106和2.5×106IU/mg；在PK-15细胞上抑制伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)增殖的活性单位分别为2.2×104、1.3×105IU/mg；在非洲绿猴肾细胞(Verda Reno,Vero)上抑制猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)增殖的活性单位为3.2×104IU/mg。本研究获得了可溶性表达的rPoIFN-α-linkerPoIL-2蛋白，该蛋白在不同细胞上具有抑制VSV、PRV、SVA及PEDV等病毒增殖的活性，为进一步研究rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在猪体内的活性提供了基础资料。

关键词：猪α干扰素猪白细胞介素-2 嵌合基因可溶性表达体外活性

非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 118-130页

作者：刘影闫若潜王东方杨海波赵美雪宋丹赵雪丽谢彩华王淑娟马震原柴茂王翠刘梅芬河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应... 详细信息

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

关键词：非洲猪瘟病毒高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重FQ-PCR

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猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 413-418页

作者：周建浩王东方刘影王淑娟马震原谢彩华赵雪丽杨海波冯桂丹康台生胡煜锋李博文闫若潜河南农业大学动物医学院郑州450046 河南省动物疫病预防控制中心/河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008 河南科技大学动物科技学院洛阳471000 上海市动物疫病预防控制中心上海201103

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异... 详细信息

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

关键词：猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR 方法建立

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闫若潜奋战在动物疫病防控一线的领军者

兽药市场指南 2020年第9期 17-18页

作者：闫若潜河南省动物疫病预防控制中心

2005年,猪链球菌爆发;2007年高致病性猪蓝耳病流行;2011年猪腹泻病和猪伪狂犬病蔓延全国;2013年和2017年,H7N9来势迅猛;2018年,非洲猪瘟国内蔓延。在事关畜牧业发展、人民生命安全的“阻击战”中,作为河南省科技创新杰出人才,河南省十... 详细信息

2005年,猪链球菌爆发;2007年高致病性猪蓝耳病流行;2011年猪腹泻病和猪伪狂犬病蔓延全国;2013年和2017年,H7N9来势迅猛;2018年,非洲猪瘟国内蔓延。在事关畜牧业发展、人民生命安全的“阻击战”中,作为河南省科技创新杰出人才,河南省十大“三农”科技领军人物、中原科技创新领军人才、“中国杰出兽医”的他,不畏风险、全力以赴,奋战在疫情防控第一线,为全省防控工作做出了重大贡献。他就是河南省动物疫病预防控制中心副主任,河南省二级研究员闫若潜。

关键词：非洲猪瘟猪伪狂犬病高致病性猪蓝耳病动物疫病防控防控工作猪链球菌畜牧业发展猪腹泻病

河南牧原食品股份有限公司七分场动物疫病净化案例--全面构建猪场疫病净化体系

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农民文摘 2022年第10期 54-57页

作者：牛旻夏德利闫若潜谢彩华河南牧原食品股份有限公司七分场河南省动物疫病预防控制中心

牧原食品股份有限公司七分场位于河南省内乡县马山镇马坪村,占地面积140亩,设计年存栏能力2800头母猪,年可提供断奶仔猪5万头、出栏原种杜洛克5万头。自2005年6月份建设,2007年1月完成投产,场区选址建设时与周边防护距离符合动物防疫条... 详细信息

牧原食品股份有限公司七分场位于河南省内乡县马山镇马坪村,占地面积140亩,设计年存栏能力2800头母猪,年可提供断奶仔猪5万头、出栏原种杜洛克5万头。自2005年6月份建设,2007年1月完成投产,场区选址建设时与周边防护距离符合动物防疫条件,周围有良好的天然防护屏障。场区内部划分为隔离区、生活区、生产区,销售区,治污区。

关键词：动物防疫条件占地面积隔离区断奶仔猪防护屏障疫病净化防护距离销售区

河南精旺猪种改良有限公司动物疫病净化案例--全流程无死角防控猪繁殖与呼吸综合征

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农民文摘 2022年第10期 50-53页

作者：原黎伟昝声远闫若潜程果河南精旺猪种改良有限公司河南省动物疫病预防控制中心

河南精旺猪种改良有限公司是一家专业为规模化养殖企业提供精准猪人工授精解决方案的服务商,可提供无野毒高性能的种猪精液产品以及全套猪人工授精解决方案。公司现有鹤壁站一座,另有在建高端种公猪站三座;设计存栏1500头,年可提供无特... 详细信息

河南精旺猪种改良有限公司是一家专业为规模化养殖企业提供精准猪人工授精解决方案的服务商,可提供无野毒高性能的种猪精液产品以及全套猪人工授精解决方案。公司现有鹤壁站一座,另有在建高端种公猪站三座;设计存栏1500头,年可提供无特定病原高性能种猪常温精液200余万剂,冷冻精液600余万剂,可满足1500余万头高品质生猪生产需要。

关键词：猪人工授精猪繁殖与呼吸综合征冷冻精液生猪生产猪种改良猪精液疫病净化常温精液

河南鲁山瑞亚牧业有限公司动物疫病净化案例--规范饲养管理持续维持净化

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农民文摘 2022年第10期 42-45页

作者：杨新亭刘珂闫若潜郭育培河南鲁山瑞亚牧业有限公司河南省动物疫病预防控制中心

鲁山瑞亚牧业有限公司(下称“公司”)位于河南省平顶山市鲁山县辛集乡清水营村,公司建立伊始,便确立了标准化、科学化、现代化的管理方法,建立了饲料、兽药、生物制品等投入品的使用制度、消毒防疫制度、生鲜乳质量安全管理制度、生产... 详细信息

鲁山瑞亚牧业有限公司(下称“公司”)位于河南省平顶山市鲁山县辛集乡清水营村,公司建立伊始,便确立了标准化、科学化、现代化的管理方法,建立了饲料、兽药、生物制品等投入品的使用制度、消毒防疫制度、生鲜乳质量安全管理制度、生产操作流程及员工培训考核制度并配有兽药使用记录、奶牛病例用药记录、奶牛档案、生鲜乳每日检查记录,档案管理制度、生产经营管理制度等。

关键词：消毒防疫档案管理制度疫病净化检查记录安全管理制度兽药使用经营管理制度生物制品

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流感病毒基因组结构及其编码蛋白研究进展

动物医学进展 2004年第1期25卷 32-35页

作者：闫若潜杜向党中国农业大学动物医学院北京100094

由流感病毒引起的流感是严重危害人类和畜禽健康的一种传染病。此病的暴发给世界上许多国家和地区造成了巨大的经济损失。对流感病毒基因组结构及其编码蛋白质的研究有助于进一步加强对流感的治疗和预防。流感病毒含 8个负链单股独立的 ... 详细信息

由流感病毒引起的流感是严重危害人类和畜禽健康的一种传染病。此病的暴发给世界上许多国家和地区造成了巨大的经济损失。对流感病毒基因组结构及其编码蛋白质的研究有助于进一步加强对流感的治疗和预防。流感病毒含 8个负链单股独立的 RNA片段 ,共编码1 0种蛋白。每种蛋白具有不同的结构和功能。文章主要对流感病毒不同基因片段的结构特征及其编码的结构蛋白及非结构蛋白的形态结构、功能。

关键词：流感病毒基因组结构编码蛋白人畜共患病负链单股形态结构免疫学特性分子生物学

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