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PLZF的克隆及其对犏牛未分化精原细胞的增殖作用

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中国农业科学 2024年第2期57卷 390-402页

作者：张鹏王明秀敬科民李雨谦田园钟金城蔡欣教育部重点实验室西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省

【目的】犏牛作为牦牛与黄牛的种间杂交产物，具有优良的生产性能，但其杂种优势的进一步应用却受限于犏牛雄性不育。通过克隆犏牛PLZF，明确其在犏牛和牦牛睾丸组织和未分化精原细胞中的差异表达，并进一步揭示过表达该基因对犏牛未分... 详细信息

【目的】犏牛作为牦牛与黄牛的种间杂交产物，具有优良的生产性能，但其杂种优势的进一步应用却受限于犏牛雄性不育。通过克隆犏牛PLZF，明确其在犏牛和牦牛睾丸组织和未分化精原细胞中的差异表达，并进一步揭示过表达该基因对犏牛未分化精原细胞活性的影响。为阐明犏牛生精停滞的作用机制提供理论基础。【方法】以24月龄公麦洼牦牛和F1代公犏牛为实验动物，通过RT-PCR法克隆得到了犏牛PLZF的CDS序列，并进行了生物信息学分析；通过RT-qPCR法分析PLZF在犏牛和牦牛睾丸组织中的差异表达；采用同源重组的方法构建了PLZF的表达载体，并利用RT-qPCR检测了PLZF过表达效率及其下游靶基因的表达；通过PDT、CCK-8、EdU和免疫荧光检测了过表达PLZF对犏牛未分化精原细胞增殖活性的影响。【结果】克隆获得了犏牛PLZF的CDS区，并通过生物信息学分析发现该基因编码的蛋白序列不包含跨膜结构域和信号肽序列，其三级结构以α螺旋和无规卷曲为主。系统进化树分析表明犏牛PLZF与黄牛PLZF的亲缘关系更近。三级结构预测发现，虽然犏牛、牦牛和黄牛的PLZF蛋白三级结构高度相似，但牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸处与犏牛和黄牛有较大差异。RT-qPCR发现，PLZF在犏牛睾丸组织和未分化精原细胞中的表达均显著低于牦牛（P<0.05），而在犏牛未分化精原细胞中过表达PLZF后，该基因的表达上调了13.8倍（P<0.01），且能显著增加犏牛未分化精原细胞的增殖活性（P<0.05），表明PLZF表达下调影响了犏牛未分化精原细胞增殖活性。此外，过表达PLZF后，犏牛未分化精原细胞中与增殖相关的基因（Etv5、Bcl6b、Pcna和c-fos）全部显著上调（P<0.05），与分化相关的基因（Stra8、Kit、Dmrt1和Sohlh2）全部显著下调（P<0.05），表明PLZF通过上调增殖相关基因、下调分化相关基因的表达促进犏牛未分化精原细胞增殖。【结论】PLZF在犏牛未分化精原细胞中表达异常降低了犏牛未分化精原细胞增殖活性，导致其数量减少，影响了犏牛的精子发生。本试验为进一步阐明犏牛生精停滞的作用机制提供了理论基础，并为解决犏牛雄性不育问题提供了新的思路。

关键词：犏牛 PLZF 未分化精原细胞增殖

排酸方式和时间对高档育肥安格斯牛肉品质的影响

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食品工业科技 2024年第11期45卷 79-85页

作者：王海波符健慧钟金城冯建华赵静李婷婷史莹华张兴隆李航河南农业大学动物科技学院河南郑州450046 河南恒都食品有限公司博士后工作站河南驻马店463700 西南民族大学青藏高原研究院四川成都610041

为探究高档牛肉的排酸技术,本研究选取12条高档育肥安格斯牛背最长肌肉为原料,通过干式和湿式排酸,选择3、5和7 d三个时间点,并对牛肉基本理化指标、游离氨基酸和挥发性风味物质综合分析。结果显示,干式排酸3和5 d牛肉pH显著低于湿式排... 详细信息

为探究高档牛肉的排酸技术,本研究选取12条高档育肥安格斯牛背最长肌肉为原料,通过干式和湿式排酸,选择3、5和7 d三个时间点,并对牛肉基本理化指标、游离氨基酸和挥发性风味物质综合分析。结果显示,干式排酸3和5 d牛肉pH显著低于湿式排酸,干式排酸7 d牛肉pH显著高于湿式排酸(P<0.05);干式排酸3 d牛肉剪切力显著低于湿式排酸(P<0.05)。干式和湿式排酸7 d牛肉中丝氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸及总游离氨基酸的含量均显著提高(P<0.05);干式排酸7 d牛肉中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和鲜味氨基酸的含量显著高于湿式排酸(P<0.05)。干式排酸和湿式排酸最主要的挥发性风味贡献物质均为壬醛、正辛醛和1-辛烯-3-醇;湿式排酸特有的挥发性风味物质为庚醛,干式排酸7 d牛肉中正辛醛、苯乙醛、十一醛、肉豆蔻醛和柠檬烯相对含量显著高于湿式排酸(P<0.05)。综上所述,排酸7 d有利于提升高档育肥安格斯牛肉风味的丰富度,干式排酸较湿式排酸对高档牛肉风味改善作用更佳。

关键词：高档育肥安格斯牛肉理化指标游离氨基酸挥发性风味物质

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过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌肉品质、挥发性风味物质及脂肪酸组成的影响

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畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1102-1114页

作者：左子珍王海波柴志欣符健慧张翔飞罗晓林钟金城青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室成都610225 四川省青藏高原草食家畜工程技术中心成都610225 四川省草原科学研究院成都611731

旨在探究过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌肉品质、挥发性风味物质及脂肪酸组成的影响。选用4岁、体重为(252.79±15.95)kg的健康麦洼公牦牛24头,将其随机分为4组:基础日粮(CON)、基础日粮加5 g·d^(-1)过瘤胃蛋氨酸(RPM1)、基础日粮加10 g·d^... 详细信息

旨在探究过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌肉品质、挥发性风味物质及脂肪酸组成的影响。选用4岁、体重为(252.79±15.95)kg的健康麦洼公牦牛24头,将其随机分为4组:基础日粮(CON)、基础日粮加5 g·d^(-1)过瘤胃蛋氨酸(RPM1)、基础日粮加10 g·d^(-1)过瘤胃蛋氨酸(RPM2)和基础日粮加15 g·d^(-1)过瘤胃蛋氨酸(RPM3),预饲10 d,舍饲70 d后屠宰。结果表明,RPM3组脂肪含量显著高于RPM1组与RPM2组(P0.05)。综上所述,日粮添加10 g·d^(-1)的过瘤胃蛋氨酸组牦牛半腱肌中风味丰富度与挥发性风味物质含量最高;日粮添加5 g·d^(-1)过瘤胃蛋氨酸组牦牛半腱肌中脂肪酸含量最高,且分布合理。

关键词：过瘤胃蛋氨酸牦牛半腱肌肉品质挥发性风味物质脂肪酸

不同嫩度牦牛背最长肌中SERPINE1基因克隆、生物信息学及表达分析

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中国畜牧兽医 2024年第6期51卷 2308-2318页

作者：敬科民张鹏李雨谦田园董文静柴志欣王吉坤钟金城蔡欣西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省/教育部重点实验室成都610041

【目的】克隆牦牛丝氨酸蛋白酶抑制剂家族E成员1(serpin family E member 1,SERPINE1)基因序列,同时探究不同嫩度牦牛背最长肌组织中SERPINE1基因核苷酸序列差异,为进一步研究其对牦牛肉嫩度的影响提供试验数据。【方法】根据GenBank中... 详细信息

【目的】克隆牦牛丝氨酸蛋白酶抑制剂家族E成员1(serpin family E member 1,SERPINE1)基因序列,同时探究不同嫩度牦牛背最长肌组织中SERPINE1基因核苷酸序列差异,为进一步研究其对牦牛肉嫩度的影响提供试验数据。【方法】根据GenBank中牦牛SERPINE1基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增克隆获得高、低嫩度牦牛背最长肌中的SERPINE1基因序列全长,并对其结构及编码蛋白进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR检测不同嫩度牦牛背最长肌中SERPINE1基因表达量。【结果】高、低嫩度牦牛背最长肌组织中SERPINE1基因全长分别为8 315和8 318 bp,均编码402个氨基酸且氨基酸序列完全相同。高、低嫩度背最长肌组织中SERPINE1基因非编码序列中存在3个碱基缺失及22个碱基突变(4个碱基颠换、18个碱基转换)。牦牛SERPINE1基因核苷酸序列与普通牛、瘤牛、美洲野牛、绵羊、山羊、家猪、人、小鼠的相似性分别为99.26%、99.26%、99.59%、96.94%、97.02%、90.49%、86.52%和80.10%。SERPINE1蛋白是一个含有23个氨基酸信号肽的亲水性稳定膜外蛋白,位于细胞外,具有34个潜在磷酸化位点,包含1个反应中心环(reactive center loop, RCL)。SERPINE1蛋白二级结构主要由α-螺旋(44.78%)和无规则卷曲(35.32%)构成。实时荧光定量PCR结果显示,SERPINE1基因在高嫩度牦牛背最长肌中表达量极显著高于低嫩度牦牛背最长肌(P<0.01)。【结论】本研究成功从高、低嫩度牦牛背最长肌组织中克隆SERPINE1基因全长并进行了生物信息学特征分析,为后续研究SERPINE1基因参与调控牦牛肉嫩度机制提供理论参考。

关键词：牦牛 SERPINE1基因嫩度生物信息学表达

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miR-138生物学功能研究进展

中国生物工程杂志 2022年第4期42卷 68-77页

作者：冉宏标王会钟金城西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省/教育部重点实验室成都610041

microRNAs(miRNAs)是真核生物体内高度保守的非编码小分子RNA,具有多种生物学功能,参与疾病发生和发展、细胞增殖和分化等多种病理及生理过程的调控。miR-138作为一种肿瘤抑制因子已在肿瘤发生与治疗中被广泛研究和应用,同时在心血管及... 详细信息

microRNAs(miRNAs)是真核生物体内高度保守的非编码小分子RNA,具有多种生物学功能,参与疾病发生和发展、细胞增殖和分化等多种病理及生理过程的调控。miR-138作为一种肿瘤抑制因子已在肿瘤发生与治疗中被广泛研究和应用,同时在心血管及神经系统疾病、成骨分化、脂肪生成及卵巢功能维持等生命过程中具有调控作用。在总结分析miR-138相关功能最新研究进展的基础上,对miR-138的潜在研究方向进行了分析、讨论和展望,旨在为进一步深入探明miR-138的生物学功能提供参考和理论依据。

关键词： miR-138 疾病成骨分化脂肪卵巢

TNNI1、TNNI3在麦洼牦牛横纹肌中的表达分析

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华北农学报 2022年第6期37卷 210-218页

作者：向娅钟金城武志娟柴志欣青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省、教育部重点实验室四川成都610041

为探索TNNI1、TNNI3在麦洼牦牛横纹肌中的表达模式,选取不同年龄麦洼牦牛臀肌、心肌组织,观察其形态学变化,开展了不同年龄麦洼牦牛TNNI1基因在臀肌组织中的表达趋势及与肌纤维性状的关联分析,同时对TNNI1、TNNI3在心肌中的mRNA和蛋白... 详细信息

为探索TNNI1、TNNI3在麦洼牦牛横纹肌中的表达模式,选取不同年龄麦洼牦牛臀肌、心肌组织,观察其形态学变化,开展了不同年龄麦洼牦牛TNNI1基因在臀肌组织中的表达趋势及与肌纤维性状的关联分析,同时对TNNI1、TNNI3在心肌中的mRNA和蛋白差异表达及蛋白定位进行了相关性分析。结果表明,随着牦牛年龄增长,肌纤维直径及密度存在一定特征性变化,其中肌纤维直径随年龄的增长显著增加,肌纤维密度则发生相反的变化。成年牦牛TNNI1基因在臀肌组织中的mRNA表达水平显著高于犊牛及断奶犊牛,变化趋势具体为成年牛>犊牛>断奶犊牛;且臀肌中TNNI1 mRNA表达水平与肌纤维直径极显著正相关,与肌纤维密度显著负相关。TNNI1在心肌中的mRNA表达水平随牦牛年龄的增大而降低,而TNNI3则表现为先升高后降低的趋势,且TNNI1在犊牛期mRNA表达水平最高,TNNI3则随年龄增长呈上调趋势。TNNI1、TNNI3蛋白在心肌组织中的表达量随牦牛年龄的增长逐渐减小,且TNNI3 mRNA表达量随牦牛年龄的增长逐渐降低,与蛋白表达趋势一致。TNNI1、TNNI3对不同年龄麦洼牦牛肌肉组织的生长发育具有显著调控作用,且在不同年龄牦牛肌肉组织中的表达水平存在差异。

关键词：牦牛 TNNI1 TNNI3 横纹肌 Western Blot 免疫组织化学

过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌肉品质、挥发性风味物质及脂肪酸组成的影响

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畜牧兽医学报 2023年

作者：左子珍王海波柴志欣符健慧张翔飞罗晓林钟金城青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室四川省青藏高原草食家畜工程技术中心四川省草原科学研究院

旨在探究过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌肉品质、挥发性风味物质及脂肪酸组成的影响。选用4岁、体重为(252.79 ± 15.95)kg的健康麦洼公牦牛24头，将其随机分为4组：基础日粮(CON)、基础日粮加5 g·d－1过瘤胃蛋氨酸(RPM1)、基础日粮加10 g·... 详细信息

旨在探究过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌肉品质、挥发性风味物质及脂肪酸组成的影响。选用4岁、体重为(252.79 ± 15.95)kg的健康麦洼公牦牛24头，将其随机分为4组：基础日粮(CON)、基础日粮加5 g·d－1过瘤胃蛋氨酸(RPM1)、基础日粮加10 g·d－1过瘤胃蛋氨酸(RPM2)和基础日粮加15 g·d－1过瘤胃蛋氨酸(RPM3)，预饲10 d，舍饲70 d屠宰。结果表明，RPM3组脂肪含量显著高于RPM1组与RPM2组(P＜0.05)；RPM1组、RPM2组、RPM3组的粗蛋白含量均显著高于CON组(P＜0.05)。牦牛半腱肌样品中共检验出42种挥发性风味物质，通过相对气味活度值计算发现，CON组、RPM1组、RPM2组和RPM3组关键挥发性风味物质分别有9种、11种、9种和10种，关键挥发性风味物质为牦牛半腱肌提供了独特的肉香与油脂香等；CON组、RPM1组与RPM2组的主要挥发性风味物质为壬醛，而RPM3组的主要挥发性物质为1-辛烯-3-醇；RPM1组的醛类物质含量最高，且具有独特的水果香味与坚果味，RPM2组的醇类与烃类物质的种类最多。四组半腱肌样品中共检测出18种脂肪酸。半腱肌CON组饱和脂肪酸总量显著低于RPM1组和RPM2组(P＜0.05)，其中RPM1组与RPM2组棕榈酸含量显著高于其他组(P＜0.05)，RPM1组二十二碳酸含量显著高于CON组和RPM3组(P＜0.05)；RPM1组单不饱和脂肪酸总量著高于RPM2组与RPM3组(P＜0.05)，其中RPM1组肉豆蔻油酸含量显著低于其他组(P＜0.05)，CON组十七碳烯酸含量显著高于其他组(P＜0.05)，RPM1组二十四碳烯酸含量显著高于RPM2组(P＜0.05)；半腱肌各组间多不饱和脂肪酸总量无差异(P＞0.05)。综上所述，日粮添加10 g·d－1的过瘤胃蛋氨酸组风味丰富度与挥发性风味物质含量最高；日粮添加5 g·d－1过瘤胃蛋氨酸组脂肪酸含量最高，且分布合理。

关键词：过瘤胃蛋氨酸牦牛半腱肌肉品质挥发性风味物质脂肪酸

基于mtDNA COX3基因对西藏特色牦牛群体遗传结构的分析

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草业学报 2023年第9期32卷 231-240页

作者：者玉琦武志娟王吉坤钟金城柴志欣信金伟青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室四川成都610225 省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室西藏拉萨850000 四川省青藏高原草食家畜工程技术中心四川成都610225

为探究西藏特色牦牛群体的遗传多样性、系统进化及亲缘关系,本研究利用PCR和直接测序法分别测定了西藏帕里牦牛、嘉黎牦牛、类乌齐牦牛、工布江达牦牛、斯布牦牛、桑日牦牛、江达牦牛7个群体共140头个体的mtDNA COX3基因蛋白质编码区(C... 详细信息

为探究西藏特色牦牛群体的遗传多样性、系统进化及亲缘关系,本研究利用PCR和直接测序法分别测定了西藏帕里牦牛、嘉黎牦牛、类乌齐牦牛、工布江达牦牛、斯布牦牛、桑日牦牛、江达牦牛7个群体共140头个体的mtDNA COX3基因蛋白质编码区(CDS)序列,利用DNAMAN、DNASP 5.1、MEGA 7.0软件分析了其序列多态性、单倍体多样性,并构建了系统发育树。结果表明,西藏牦牛群体的COX3基因CDS序列长度均为781 bp,共检测获得55个变异位点。在140头个体中共检测出11种单倍型,平均单倍型多样性(H_(d))及核苷酸多样性(P_(i))分别为0.665和0.00480,说明西藏牦牛具有丰富的遗传多样性。西藏7个牦牛群体可分为2大类,类乌齐牦牛单独聚为一类,其余牦牛群体为一类。此外,11种单倍型可分为2个聚类簇,说明西藏牦牛可能存在两个母系起源。西藏7个牦牛群体可划分到家牦牛、原牛和普通牛三大单倍型群体中,其中Hap_2、Hap_3、Hap_4、Hap_6、Hap_7、Hap_8、Hap_10、Hap_11这8个单倍型属于家牦牛支系,Hap_5和Hap_9属于原牛和普通牛支系,Hap_1属于野牦牛支系,说明家牦牛、原牛和普通牛是西藏牦牛的混合母系起源,但受家牦牛影响较大。研究结果旨在为西藏牦牛的演化、遗传多样性以及遗传资源保护和利用提供理论依据。

关键词：西藏牦牛 COX3基因遗传多样性系统进化

miR-138靶向PGC-1α调控牦牛肌内前体脂肪细胞增殖及分化

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畜牧兽医学报 2022年第10期53卷 3434-3447页

作者：冉宏标王会柴志欣王嘉博张明蔡欣钟金城西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省/教育部重点实验室成都610041 西南民族大学青藏高原研究院成都610041

旨在分析miR-138在牦牛前体脂肪细胞分化过程中的调控作用。本研究设计合成miR-138 mimics和inhibitor以对细胞进行miR-138过表达及抑制表达,并通过油红O染色分析miR-138对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响;利用CCK-8、划痕和流式细... 详细信息

旨在分析miR-138在牦牛前体脂肪细胞分化过程中的调控作用。本研究设计合成miR-138 mimics和inhibitor以对细胞进行miR-138过表达及抑制表达,并通过油红O染色分析miR-138对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响;利用CCK-8、划痕和流式细胞技术分析miR-138对细胞增殖的影响;通过对bta-miR-138进行生物信息学分析,筛选其在脂质沉积过程中的相关潜在靶基因;利用RT-qPCR测定miR-138潜在靶基因mRNA表达水平,并通过双荧光素酶报告试验确定靶向关系。结果显示,过表达miR-138后,细胞内脂滴沉积水平显著低于对照(NC)组(P<0.01),而抑制miR-138表达则显著增强脂肪细胞脂质沉积(P<0.01);RT-qPCR结果表明,过表达miR-138可显著抑制脂肪分化标志基因PPARγ和c/EBPα的表达(P<0.01),抑制miR-138则上调PPARγ和c/EBPα表达水平(P<0.05);此外,过表达miR-138后,潜在靶基因PTPN11、CREB1和ADCYAP1R1表达水平显著下调(P<0.05),而PGC-1α和SNAP25表达极显著下调(P<0.01);抑制miR-138后MXLIP和SNAP25表达显著上调(P<0.05),PGC-1α和PTPN11表达极显著上调(P<0.01);CCK-8和划痕试验结果表明,过表达miR-138后24~36 h,细胞增殖活性显著低于对照组(P<0.05),而抑制miR-138则表现为细胞增殖活性增强;流式分析结果显示过表达miR-138后,细胞出现G1-S期阻滞,细胞周期相关基因CCND1、CCNB1和增殖标志基因Ki67的mRNA表达显著降低;生物信息学分析预测获得263个miR-138公共靶基因,KEGG富集结果显示靶基因主要参与“轴突导引”、“胰岛素抵抗”、“胰岛素分泌”及“RNA降解”等通路,GO分析主要富集于“RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控”、“核染色质”、“染色质DNA结合”和“I型肺细胞分化”等功能;双荧光素酶报告试验结果显示,共转染miR-138 mimics和PGC-1α-Wt-PGL3-basic可显著降低细胞荧光强度(P<0.01)。以上结果表明,miR-138可通过靶向结合PGC-1α3′UTR序列,降低PGC-1α的mRNA表达水平,抑制牦牛肌内前体脂肪细胞分化和脂质沉积,降低细胞增殖活性。本研究为阐明牦牛肉质性状的潜在分子机制提供参考。

关键词：牦牛 miR-138 PGC-1α 前体脂肪细胞增殖分化