PLZF的克隆及其对犏牛未分化精原细胞的增殖作用

作     者：张鹏 王明秀 敬科民 李雨谦 田园 钟金城 蔡欣 ZHANG Peng;WANG MingXiu;JING KeMin;LI YuQian;TIAN Yuan;ZHONG JinCheng;CAI Xin

作者机构：教育部重点实验室 西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省 

出 版 物：《中国农业科学》 (Scientia Agricultura Sinica)

年 卷 期：2024年第57卷第2期

页      面：390-402页

核心收录：

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

基　　金：西南民族大学“双一流”项目(XM2023019) 四川省科学技术厅应用基础科技项目(2021YJ0268) 

主　　题：犏牛 PLZF 未分化精原细胞 增殖 

摘      要：【目的】犏牛作为牦牛与黄牛的种间杂交产物，具有优良的生产性能，但其杂种优势的进一步应用却受限于犏牛雄性不育。通过克隆犏牛PLZF，明确其在犏牛和牦牛睾丸组织和未分化精原细胞中的差异表达，并进一步揭示过表达该基因对犏牛未分化精原细胞活性的影响。为阐明犏牛生精停滞的作用机制提供理论基础。【方法】以24月龄公麦洼牦牛和F1代公犏牛为实验动物，通过RT-PCR法克隆得到了犏牛PLZF的CDS序列，并进行了生物信息学分析；通过RT-qPCR法分析PLZF在犏牛和牦牛睾丸组织中的差异表达；采用同源重组的方法构建了PLZF的表达载体，并利用RT-qPCR检测了PLZF过表达效率及其下游靶基因的表达；通过PDT、CCK-8、EdU和免疫荧光检测了过表达PLZF对犏牛未分化精原细胞增殖活性的影响。【结果】克隆获得了犏牛PLZF的CDS区，并通过生物信息学分析发现该基因编码的蛋白序列不包含跨膜结构域和信号肽序列，其三级结构以α螺旋和无规卷曲为主。系统进化树分析表明犏牛PLZF与黄牛PLZF的亲缘关系更近。三级结构预测发现，虽然犏牛、牦牛和黄牛的PLZF蛋白三级结构高度相似，但牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸处与犏牛和黄牛有较大差异。RT-qPCR发现，PLZF在犏牛睾丸组织和未分化精原细胞中的表达均显著低于牦牛（P0.05），而在犏牛未分化精原细胞中过表达PLZF后，该基因的表达上调了13.8倍（P0.01），且能显著增加犏牛未分化精原细胞的增殖活性（P0.05），表明PLZF表达下调影响了犏牛未分化精原细胞增殖活性。此外，过表达PLZF后，犏牛未分化精原细胞中与增殖相关的基因（Etv5、Bcl6b、Pcna和c-fos）全部显著上调（P0.05），与分化相关的基因（Stra8、Kit、Dmrt1和Sohlh2）全部显著下调（P0.05），表明PLZF通过上调增殖相关基因、下调分化相关基因的表达促进犏牛未分化精原细胞增殖。【结论】PLZF在犏牛未分化精原细胞中表达异常降低了犏牛未分化精原细胞增殖活性，导致其数量减少，影响了犏牛的精子发生。本试验为进一步阐明犏牛生精停滞的作用机制提供了理论基础，并为解决犏牛雄性不育问题提供了新的思路。