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中国人苯丙氨酸羟化酶基因的10种新突变

中国医学科学院学报 2003年第2期25卷 142-144页

作者：宋昉金煜炜王红杨艳玲张玉敏张霆首都儿科研究所遗传室北京100020

目的研究中国人苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变的分子基础。方法应用PCR/SSCP、序列分析等技术,分析中国北方地区120个经典型苯酮尿症(PKU)核心家系,对PAH基因外显子3、5、7、10、11、12进行突变基因的筛查和确定。结果在确定的31种突... 详细信息

目的研究中国人苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变的分子基础。方法应用PCR/SSCP、序列分析等技术,分析中国北方地区120个经典型苯酮尿症(PKU)核心家系,对PAH基因外显子3、5、7、10、11、12进行突变基因的筛查和确定。结果在确定的31种突变中(另文报道)有10种突变首次在中国PKU人群中发现:165T、S70del、G239D、R241fsdelG、L255S、P281L、G346R、L367fsinsC、R400S和Ivsllnt2t→c。其中4种突变G239D、R241fsdelG、R400S和Ivsllnt2t→c在国际PAH数据库未见公布(至投稿日期)。新突变显示中国人PAH基因虽以点突变为主,但存在小的碱基插入、缺失以及移码突变。新突变主要发生在外显子7中(4/10),每种突变的发生频率均很低(0.42％-1.3％)。结论中国人PAH基因存在高度异质性和突变的多样性,外显子7是PAH基因的突变热点区域。

关键词：苯丙氨酸羟化酶基因突变异质性单链构象多态性序列分析

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高速公路联网收费通行费拆分研究

高速公路联网收费通行费拆分研究

作者：金煜炜长安大学

学位级别：硕士

随着我国高速公路的快速发展,多数省份的高速公路实现了联网收费,由此导致的通行费拆分问题日趋突出。为了公平合理地解决通行费拆分问题,促进联网收费实施,本文针对高速公路联网收费的通行费拆分问题,探索我国在高速公路联网收费环境... 详细信息

随着我国高速公路的快速发展,多数省份的高速公路实现了联网收费,由此导致的通行费拆分问题日趋突出。为了公平合理地解决通行费拆分问题,促进联网收费实施,本文针对高速公路联网收费的通行费拆分问题,探索我国在高速公路联网收费环境下如何公平合理地拆分收费金额的有效方法,为通行费拆分提供依据。为此,本文首先研究了路径识别方法对通行费拆分的意义,分析了各种路径识别方法的原理、各自的优缺点以及影响路径识别方法选择的各种相关因素;其次,分析了通行费拆分点的确定方法,重点介绍基于概率拆分的各种通行费拆分方法,对各自的优缺点进行分析比较,并研究了确定概率函数的方法;最后,针对河南省具体情况,论述了河南省高速公路网的拆分方案的具体实现。

关键词：联网收费费用拆分路径识别概率分析

SMN2拷贝数和fl-SMN2转录水平对脊髓性肌萎缩症表型及生存的影响

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中华实用儿科临床杂志 2023年第11期38卷 863-868页

作者：欧阳世佳白晋丽金煜炜王红黄文琛彭晓音葛绣山焦辉瞿宇晋宋昉首都儿科研究所遗传室北京100020 首都儿科研究所附属儿童医院神经内科北京100020

目的探讨运动神经元存活基因2(SMN2)拷贝数及SMN2全长转录本(fl-SMN2)水平在脊髓性肌萎缩症(SMA)1-3型患儿中的分布,明确其对疾病表型、进展及预后评估的意义及影响。方法回顾性分析2019年1月至2021年12月到首都儿科研究所就诊并经基因... 详细信息

目的探讨运动神经元存活基因2(SMN2)拷贝数及SMN2全长转录本(fl-SMN2)水平在脊髓性肌萎缩症(SMA)1-3型患儿中的分布,明确其对疾病表型、进展及预后评估的意义及影响。方法回顾性分析2019年1月至2021年12月到首都儿科研究所就诊并经基因诊断为SMN1纯合缺失且未经治疗的78例SMA患儿的临床资料,采集患儿的临床横断面数据,包括发病年龄、获得的运动功能、并发症等,并随访采集运动功能退化及生存数据,同时测定患儿携带的SMN2拷贝数和fl-SMN2转录水平,应用t检验或单因素方差分析或χ2检验进行组间比较,Kaplan-Meier分析用于生存分析,Kendall′s tau-c分析这两个标志物与疾病表型、发病年龄、运动进展及结局之间的相关性。结果78例SMA患儿中1型为17例(21.8%),2型34例(43.6%),3型27例(34.6%)。约41.2%(7/17)的1型患儿死亡,中位生存年龄为11个月,2型和3型患儿中未观察到死亡。携带2、3和4个SMN2拷贝患儿的中位发病年龄分别为1.8、12.0和24.0个月(F=4.943,P=0.01),fl-SMN2转录水平均值分别为196.25±68.79、331.21±108.79和455.69±122.27(F=37.154,P<0.001)。2拷贝SMN2的患儿1年、2年和5年时的生存率分别为50.5%、0、0,中位生存期为7个月,而在3拷贝和4拷贝的5年生存率分别为97.4%和100.0%。fl-SMN2转录水平与SMA表型严重程度呈负相关(Kendall′s tau-c=-0.444,P<0.001),且存活患儿的fl-SMN2转录水平(342.93±125.74)明显高于死亡患儿的水平(212.14±92.31)。在运动功能的获得方面均表现出SMN2拷贝数越多,fl-SMN2转录水平越高,获得的运动功能也越多的趋势(P<0.001)。此外,fl-SMN2转录水平在独坐和独站功能未退化组和功能退化组差异有统计学意义(F=5.432,P=0.023;F=4.315,P=0.047)。结论SMN2拷贝数和fl-SMN2转录水平均与SMA表型严重程度和生存状况有关,是评估SMA表型重要的生物标志物。fl-SMN2转录水平还可能与独坐和独站功能的退化相关。

关键词：脊髓性肌萎缩症 SMN2拷贝数 fl-SMN2转录水平相关性评估

PCR限制性内切酶法在苯丙酮尿症突变基因诊断中的应用

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中华检验医学杂志 2008年第2期31卷 186-187页

作者：王红金煜炜宋防首都儿科研究所遗传室北京100020

苯丙酮尿症（PKU）是一种常染色体隐性遗传病，由苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变导致肝脏PAH酶活性降低或丧失所致。临床表现为不可逆的智力发育迟滞、癫痫等症状。新生儿筛查显示，PKU在中国人群中发病率为1／11000。在中国人pah基因... 详细信息

苯丙酮尿症（PKU）是一种常染色体隐性遗传病，由苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变导致肝脏PAH酶活性降低或丧失所致。临床表现为不可逆的智力发育迟滞、癫痫等症状。新生儿筛查显示，PKU在中国人群中发病率为1／11000。在中国人pah基因的已知突变中，一些突变改变了基因序列中限制性内切酶的酶切位点。为此，我们应用PCR限制性内切酶法（PCR-RFLP）直接检测一些改变了限制性内切酶酶切位点的突变基因。

关键词：限制性内切酶法苯丙酮尿症基因突变 PCR 基因诊断常染色体隐性遗传病苯丙氨酸羟化酶智力发育迟滞

PCR-RFLP法在脊髓性肌萎缩症基因检测中的局限性

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中华医学遗传学杂志 2012年第1期29卷 34-37页

作者：金煜炜瞿宇晋王红白晋丽宋昉首都儿科研究所医学遗传学研究室北京100020

目的探讨聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术在脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）基因诊断中的应用。方法用PCR-RFLP分析935例临床疑似SMA患儿的运动神经元存活基因1（survivalmotor neuron，SMNl）第7和第8外显子的缺失，同时用多重连接探针扩增技术（multiplexligation-dependent probe amplification，MLPA）分析其中339例疑似病例的SMNl基因拷贝数改变。用Pearson卡方检验分析两种方法检测SMNl纯合和杂合性缺失的一致性。结果共发现SMNl基因第7外显子纯合缺失590例，疑似患者的SMA基因诊断率为63．1％（590／935）。用PCR_RFLP和MLPA技术联合分析疑似病例339例，PCR-RFLP共发现SMNl纯合缺失194例，MLPA发现196例，二者的一致性为98．9％，差异无统计学意义（X2=0．2，P=0．88）。PCR-RFLP仅发现SMNl疑似杂合性缺失4例，而MLPA证实有17例，二者的一致性为23．5％，差异有统计学意义（X2=8．29，P〈0．01）。结论PCR-RFLP尽管简便、特异、实用，但对于5％-10％SMNl杂合缺失合并点突变的病例则存在明显的局限性。

关键词：脊髓性肌萎缩症运动神经元存活基因1 限制性片段长度多态性多重连接探针扩增技术

九个苯丙氨酸羟化酶基因单点突变重组质粒的构建和鉴定

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解放军医学杂志 2008年第5期33卷 527-530页

作者：白晋丽瞿宇晋金煜炜王红宋昉首都儿科研究所遗传室北京100020

目的构建Y154H、R157I、Y206C、G247R、D282G、G346R、S349A、A389G、R400K9个PAH基因突变型重组质粒,为下一步研究这些PAH突变体在哺乳动物细胞中表达蛋白功能奠定基础。方法①选择错义突变位点。结合突变位点所在酶蛋白的结构域(如催... 详细信息

目的构建Y154H、R157I、Y206C、G247R、D282G、G346R、S349A、A389G、R400K9个PAH基因突变型重组质粒,为下一步研究这些PAH突变体在哺乳动物细胞中表达蛋白功能奠定基础。方法①选择错义突变位点。结合突变位点所在酶蛋白的结构域(如催化结构域或与辅因子BH4结合位点)及患儿相关临床表型进行了9个突变位点的选择。②构建PAH基因突变型重组质粒。以野生型PAH真核表达载体pcDNA3.0-PAH-wt为模板,应用PrimerPremier5.0软件自行设计了9对突变引物,并在Platin-iumTaqDNA高保真聚合酶的作用下直接利用体外PCR定点突变法构建PAH基因突变型重组质粒。③初筛PAH基因突变型重组质粒。氨苄抗性初步筛选:利用重组基因含氨苄青霉素抗性基因的特点,可筛选出阳性克隆;PCR及酶切技术筛选:根据野生型与突变型靶序列酶切片段的差异进行筛选,其中S349A、D282G、G247R、Y206C、Y154H这5种突变存在MvaⅠ、MvaⅠ、HindⅢ、RsaⅠ、RsaⅠ的天然酶切位点,而R157I、G346R、A389G、R400K与其相应的野生型所在位点周围并不存在天然的酶切位点,需要在目的位点的上/下游设计引物,即人工构建DdeⅠ、HindⅢ、PstⅠ、MvaⅠ酶切位点,然后利用上述限制性内切酶进行突变体的酶切鉴定。④验证PAH基因突变型重组质粒,突变体最终由DNA测序加以验证。结果这9个突变型PAHcDNA序列除特定碱基位点被突变的碱基替换外,其他序列和野生型的完全保持一致。结论成功构建了9个PAH基因突变型重组质粒。体外定点突变技术准确、实用。

关键词： PAH基因点突变质粒

联合应用PCR-单链构象多态性和短串联重复序列连锁分析方法进行20例苯丙酮尿症产前基因诊断

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中华医学遗传学杂志 2008年第1期25卷 110-111页

作者：金煜炜李莎莎王红宋昉首都儿科研究所医学遗传室北京100020 北京市妇产医院

目的建立技术简便、准确性高的苯丙酮尿症产前基因诊断方法，探索遗传性疾病的产前基因诊断的临床应用价值。方法应用聚合酶链反应．单链构象多态性和短串联重复序列连锁分析的方法，对20例经典型苯丙酮尿症再怀孕家系进行了产前基因诊... 详细信息

目的建立技术简便、准确性高的苯丙酮尿症产前基因诊断方法，探索遗传性疾病的产前基因诊断的临床应用价值。方法应用聚合酶链反应．单链构象多态性和短串联重复序列连锁分析的方法，对20例经典型苯丙酮尿症再怀孕家系进行了产前基因诊断。结果经过产后基因诊断和新生儿血苯丙氨酸浓度筛查的验证，取得令人满意的产前诊断结果。结论联合应用聚合酶链反应．单链构象多态性和短串联重复序列方法是技术简便、准确性高的产前基因诊断方法，具有较高的临床应用价值。

关键词：产前基因诊断单链构象多态性短串联重复序列连锁分析

酶切法检测6-丙酮酰基四氢蝶呤合成酶基因常见突变

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中华医学遗传学杂志 2006年第6期23卷 680-682页

作者：瞿宇晋宋昉王红金煜炜首都儿科研究所遗传室北京100020

目的建立一种快速、特异的限制性内切酶酶切分析法检测中国人6-丙酮酰基四氢蝶呤合成酶(6-pyruvoyl-tetrahydropterinsynthase,PTPS)基因的常见突变。方法应用人工构建的酶切位点,对4例四氢生物喋呤缺乏症(tetrahydrobiopterindeficienc... 详细信息

目的建立一种快速、特异的限制性内切酶酶切分析法检测中国人6-丙酮酰基四氢蝶呤合成酶(6-pyruvoyl-tetrahydropterinsynthase,PTPS)基因的常见突变。方法应用人工构建的酶切位点,对4例四氢生物喋呤缺乏症(tetrahydrobiopterindeficiency,BH4D)患儿及其父母进行限制性片段长度多态性(restric-tionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析,检测中国人最常见的3种PTPS基因突变N52S、P87S和D96N;同时采用测序的方法验证PCR-RFLP的结果。结果4例BH4D患儿的PTPS突变基因型为N52S/-、P87S/D96N、N52S/D96N和D96N/-;PCR-RFLP分析与DNA测序结果一致。结论(1)人工引入酶切位点的酶切方法操作简便、特异性好,适于PTPS基因常见突变的临床检测;⑵高苯丙氨酸血症(hyperpheny-lalaninemia,HPA)患儿有必要进一步分析PTPS基因,以便早期鉴别BH4D,选择正确的治疗方案。

关键词：四氢生物蝶呤缺乏症 6-丙酮酰基四氢蝶呤合成酶基因突变检测聚合酶链反应-限制性片段长度多态性

苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因外显子7及其两侧内含子的突变研究

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遗传 2005年第1期27卷 53-56页

作者：宋昉金煜炜王红张玉敏杨艳玲张霆首都儿科研究所北京100020 北京市新生儿疾病筛查中心北京100006 北京大学第一医院北京100034

为探讨中国苯丙酮尿症(PKU)人群中苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因外显子7的突变特征,对147例PKU患儿的294个PAH基因外显子7以及两侧部分内含子序列,应用PCR 单链构象多态性(SSCP)分析及基因序列分析的方法进行了筛查和确定。共发现13种突变基... 详细信息

为探讨中国苯丙酮尿症(PKU)人群中苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因外显子7的突变特征,对147例PKU患儿的294个PAH基因外显子7以及两侧部分内含子序列,应用PCR 单链构象多态性(SSCP)分析及基因序列分析的方法进行了筛查和确定。共发现13种突变基因:G239D、R241C、R241fs、R243Q、G247S、G247V、R252Q、L255S、R261Q、M276K、E280G、P281L、Ivs7+2T>A,其中7种突变基因在中国PKU人群首次发现;G239D、R241fs、G247S、E280G、L255S、R261Q、P281L,前4种在国际上尚未见到报道,并已提交到国际PAH突变数据库(www.***.mcgill.ca)。突变基因的总频率为30.61%(90/294)。突变涉及了错义、缺失、移码和剪接位点4种突变类型。结果明确了PAH基因外显子7的突变种类和分布等特征,表明外显子7是中国人PAH基因突变的热点区域。

关键词：苯丙氨酸羟化酶外显子基因突变单链构象多态性序列分析