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猪源G3BP1基因的稳定敲低PK-15细胞系构建及生物信息学分析

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微生物学通报 2024年第3期51卷 970-984页

作者：林馨倩郭紫晶张瑞向晗一林含睿黄雄挺陈劲松张志东李彦敏西南民族大学动物医学四川省高校重点实验室四川成都610041

【背景】Ras-GTP酶活化蛋白SH3结构域结合蛋白1(Ras-GTPase-activating protein SH3 domain binding protein 1,G3BP1)是应激颗粒(stress granule,SG)的重要组成部分和标志性蛋白,在宿主抵抗病原体入侵过程中发挥重要作用。【目的】构建G3BP1稳定敲低的PK-15细胞系,探究敲低G3BP1基因对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、塞内卡病毒(seneca virus,SVV)和痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)复制的影响和对肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、抗黏病毒蛋白1(myxovirus resistance protein 1,Mx1)、干扰素刺激基因54(IFN-stimulated gene 54,ISG54)和干扰素β(interferonβ,IFN-β)表达的影响,并对该基因进行生物信息学分析。【方法】利用慢病毒载体构建稳定敲低G3BP1基因的PK-15细胞系,利用逆转录实时定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析敲低G3BP1基因对VSV、SVV和VACV复制的影响,利用RT-qPCR分析感染VSV、SVV和VACV后敲低G3BP1基因对TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的影响,通过在线工具对G3BP1基因进行生物信息学分析。【结果】RT-qPCR和免疫印迹(Western blotting,WB)结果显示成功构建稳定敲低G3BP1的PK-15细胞系;RT-qPCR和qPCR结果显示敲低G3BP1基因可极显著促进VSV和SVV的复制(P0.05);RT-qPCR结果显示VSV和SVV感染可显著或极显著促进TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的mRNA表达水平(P0.05);理化性质预测结果显示,猪源G3BP1蛋白存在30个磷酸化位点,具有不稳定性和亲水性,属于非跨膜和非分泌蛋白;蛋白质高级结构预测显示,该蛋白的二级结构主要由无规则卷曲(52.47%)组成,主要定位于细胞质和细胞核中,分别占34.38%和31.25%。【结论】本研究获得了猪源G3BP1基因稳定敲低的PK-15细胞系,敲低该基因可极显著促进VSV和SVV的复制,但对VACV的复制无显著影响;敲低该基因可显著或极显著抑制TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的产生;预测该蛋白存在30个磷酸化位点,为非跨膜和非分泌蛋白,具有不稳定性和亲水性。这些结果可为进一步研究G3BP1在病毒感染过程中的作用机制提供工具和参考依据。

关键词： PK-15细胞 G3BP1基因细胞因子生物信息学

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三重TaqMan qPCR检测呼吸道感染衣原体方法的建立及应用

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国际检验医学杂志 2024年第S1期45卷 62-69页

作者：何琪富夏丽君苟升东肖胜郭紫晶成都市武侯区人民医院/武侯区妇幼保健院四川成都610041 西南民族大学畜牧兽医学院四川成都610041

目的本试验的目的是建立可以快速鉴别诊断呼吸道感染肺炎衣原体(Cpn)、鹦鹉热衣原体(Cps)和沙眼衣原体(Ct)的三重TaqMan qPCR方法,有助于衣原体病的科学防控和指导临床用药,为公共卫生安全提供保障。方法选择Cpn、Cps和Ct特异基因ARGR、... 详细信息

目的本试验的目的是建立可以快速鉴别诊断呼吸道感染肺炎衣原体(Cpn)、鹦鹉热衣原体(Cps)和沙眼衣原体(Ct)的三重TaqMan qPCR方法,有助于衣原体病的科学防控和指导临床用药,为公共卫生安全提供保障。方法选择Cpn、Cps和Ct特异基因ARGR、ompA和ORF8设计引物,建立标准曲线,优化反应条件和体系,验证方法的灵敏度、重复性;通过单独检测3种衣原体的荧光定量PCR方法验证本研究建立方法的准确性。结果结果显示,所建立的三重TaqMan qPCR方法特异度和重复性好,检测灵敏度分别为45 copy/μL(Cpn)、40 copy/μL(Cps)和43 copy/μL(Ct);利用该方法对600个临床样本进行检测,其检出率与参考方法比较,差异无统计学意义(P>0.05),表明该方法检测结果可靠。结论本研究建立的检测呼吸道感染衣原体的三重TaqMan qPCR方法特异性和重复性好,灵敏度高,结果可靠,为呼吸道感染衣原体临床诊治和流行病学监控提供有力工具。

关键词：呼吸道感染肺炎衣原体鹦鹉热衣原体沙眼衣原体实时荧光定量PCR

人兽共患衣原体病原学特点和诊断方法的研究进展

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预防医学情报杂志 2024年第3期40卷 337-348页

作者：何琪富肖胜苟升东夏丽君郭紫晶成都市武侯区人民医院成都610041 成都市武侯区妇幼保健院成都610041 西南民族大学畜牧兽医学院成都610041

21世纪以来,人兽共患病已成为公共卫生关注的热点。衣原体是一类分布广泛、在细胞内寄生、有独特双相发育周期的原核细胞性病原体,部分衣原体种可以感染包括人类在内的多种哺乳动物以及鸟类,引起眼、关节、呼吸系统、神经系统、泌尿生... 详细信息

21世纪以来,人兽共患病已成为公共卫生关注的热点。衣原体是一类分布广泛、在细胞内寄生、有独特双相发育周期的原核细胞性病原体,部分衣原体种可以感染包括人类在内的多种哺乳动物以及鸟类,引起眼、关节、呼吸系统、神经系统、泌尿生殖系统疾病,治愈不及时甚至可引起死亡,对动物产品和人类健康等公共卫生安全领域产生严重威胁。本文从人兽共患衣原体的生物学特征、流行病学、临床特征以及实验室检测方法等方面进行综述,以期为人兽共患衣原体疫情监测工作及防控提供参考,为公共卫生安全和畜牧业健康发展提供保障。

关键词：人兽共患病衣原体病原学临床症状实验室检测

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鉴定冰糖橙芽变系列品种遗传变异的研究

鉴定冰糖橙芽变系列品种遗传变异的研究

作者：郭紫晶湖南农业大学

学位级别：硕士

冰糖橙是湖南省重点推广的甜橙品种,经多年品种改良,涌现了一批优良的芽变品种,使得其品质得到了大幅提升。然而,芽变品种遗传相似度极高,品种鉴定非常困难,生产中常出现品种混杂、良种被假冒、套牌生产等侵犯知识产权的问题,严重损害... 详细信息

冰糖橙是湖南省重点推广的甜橙品种,经多年品种改良,涌现了一批优良的芽变品种,使得其品质得到了大幅提升。然而,芽变品种遗传相似度极高,品种鉴定非常困难,生产中常出现品种混杂、良种被假冒、套牌生产等侵犯知识产权的问题,严重损害了育种者的权益,因此准确有效的鉴定冰糖橙芽变品种有助于产业健康有序的发展。本研究以冰糖橙系列品种为试验材料,通过对其表型性状的观察与分析,筛选核心表型性状,利用全基因组重测序技术,开发特异分子标记,用以鉴定冰糖橙芽变系列品种。研究结果如下:1.表型观测8个冰糖橙及其他45个柑橘主栽品种,参考DUS测试指南,聚焦冰糖橙系列品种的87个性状表现,以确定冰糖橙系列品种特异表型性状。结果表明:表型观测能将柚类、宽皮柑橘类与橙类进行区分,冰糖橙品种与橙类品种聚类在一起。8个冰糖橙品种物候期相近,差异主要集中在叶片、果实性状。结合主成分分析法,筛选出叶形、果形及果皮颜色等11个核心鉴定性状,能够鉴定部分冰糖橙芽变品种。2.基于柑橘基因组重测序数据,构建群体基因组,利用生物信息学软件进行个性化分析,开发SSR、SV和Indel标记。(1)采用Perl程序检索10个参考基因组,得到20,416个SSR位点,二核苷酸的碱基组合的串联重复类型最多,平均每个基因组有9,497个SSR位点,约占所有SSR位点的46.52%;六核苷酸重复类型最少,仅占所有重复位点的1.28%。50对SSR标记中有1对能对红肉冰糖橙进行区分。(2)构建了部分橙类品种群体基因组,据此设计了的20对SV标记,其中有4对标记能从21个主栽品种中鉴别冰糖橙品种。(3)平均每个冰糖橙样品生成710,042条Indel变异序列,变异多为1-10bp范围。100对Indel标记中,6对能够鉴定8个冰糖橙品种的标记。综上,表型性状可对冰糖橙芽变品种进行初步鉴定,开发出11对分子标记能够鉴别冰糖橙芽变品种。通过注释变异序列发现,标记扩增的序列多位于尚未表征的基因间。

关键词：冰糖橙芽变品种形态学标记分子鉴定

陕西省与河南省猪场猪繁殖障碍与呼吸综合征流行病学调查与序列分析

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畜禽业 2024年第3期35卷 1-10页

作者：黄雄挺郭紫晶周泷陈劲松张志东李彦敏西南民族大学动物医学四川省高校重点实验室四川成都610041

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是影响全球养猪业的主要疾病之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的突变率是RNA病毒中最高的。为了解其分子特征和遗传变异,对陕西和河南地区猪场采集的252份... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是影响全球养猪业的主要疾病之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的突变率是RNA病毒中最高的。为了解其分子特征和遗传变异,对陕西和河南地区猪场采集的252份疑似样本采用RT-PCR检测技术和生物信息学软件进行了ORF5基因和Nsp2基因序列比对和遗传变异分析。结果显示:252份样本中阳性样品为39份,阳性率为15.6%。对39份阳性样品克隆测序获得10条Nsp2基因阳性样品序列和5条ORF5基因阳性品序列;5株PRRSV ORF5基因毒株与GenBank中26株PRRSV参考毒株的ORF5基因之间的核苷酸序列同源性为79.7%~99.7%,10株PRRSV毒株Nsp2基因的核苷酸序列同源性为38.2%~92.2%,其中5株ORF5基因的GP5-5、GP5-7、GP5-10毒株为PRRSV-2型谱系1的毒株,99L、100L毒株为PRRSV-2型谱系5的毒株,分别与代表株NADC30和VR-2332亲缘关系最近;10株PRRSV毒株Nsp2基因均为PRRSV-2型谱系1的毒株,与代表株NADC30亲缘关系最接近。GP5蛋白与NSP蛋白均发生不同程度的变异,说明PRRSV毒株变异频繁,因此,实时监测PRRSV株系的遗传变异动态,探索其遗传变异模式,可为疫病防控提供科学参考。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征 ORF5基因序列分析 Nsp2基因遗传进化分析

白细胞介素-10对口蹄疫病毒感染小鼠T细胞增殖及其表达TNF-α、IFN-γ和IL-2的影响

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畜牧兽医学报 2023年第2期54卷 694-705页

作者：郭紫晶陈飞张志雄柏玲张志东李彦敏西南民族大学畜牧兽医学院成都610041 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室OIE/国家口蹄疫参考实验室兰州730046

白细胞介素-10(IL-10)增高是口蹄疫病毒(FMDV)感染过程中显著特征之一。本研究旨在探讨IL-10对FMDV感染小鼠外周血T细胞增殖及其表达效应功能相关细胞因子的影响。采用CCK-8和流式细胞术分别检测小鼠外周血T细胞增殖和T细胞表达效应功... 详细信息

白细胞介素-10(IL-10)增高是口蹄疫病毒(FMDV)感染过程中显著特征之一。本研究旨在探讨IL-10对FMDV感染小鼠外周血T细胞增殖及其表达效应功能相关细胞因子的影响。采用CCK-8和流式细胞术分别检测小鼠外周血T细胞增殖和T细胞表达效应功能相关细胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-2)。结果显示,与对照小鼠相比,FMDV感染小鼠(感染12、24、36和48 h)外周血T细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖均显著下降(P<0.05或P<0.01);FMDV感染小鼠的外周血CD4^(+)T细胞表达TNF-α和IL-2均显著下降(均P<0.01),CD8^(+)T细胞表达TNF-α、IFN-γ和IL-2也显著下降(P<0.01或P<0.0001)。体内阻断IL-10/IL-10R信号或者敲除IL-10均能显著恢复FMDV感染小鼠外周血T细胞的增殖(P<0.05或P<0.01),但不影响CD4^(+)和CD8^(+)T细胞表达TNF-α、IFN-γ和IL-2。本研究首次揭示FMDV能抑制小鼠外周血T细胞增殖及其表达TNF-α、IFN-γ和IL-2,其有助于FMDV逃避宿主免疫反应。尽管体内阻断IL-10/IL-10R信号或者敲除IL-10不影响CD4+和CD8+T细胞的表达TNF-α、IFN-γ和IL-2,但其有助于恢复外周血T细胞的增殖能力,该结果为FMD新型防控产品的研发提供新的思路。

关键词：口蹄疫病毒白细胞介素-10 T细胞细胞增殖细胞因子

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牛Nebovirus的分子检测和基因组研究

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牛Nebovirus的分子检测和基因组研究

作者：郭紫晶西南民族大学

学位级别：硕士

Newbury-1 virus目前是杯状病毒科(Caliciviridae family)纽布病毒属(Nebovirus genus)唯一成员,常用Nebovirus(NeV)表述。NeV为单股正链RNA病毒,是致犊牛腹泻的病毒。迄今为止,NeV已经在美国、英国、巴西、土耳其、日本等12个国家检出... 详细信息

Newbury-1 virus目前是杯状病毒科(Caliciviridae family)纽布病毒属(Nebovirus genus)唯一成员,常用Nebovirus(NeV)表述。NeV为单股正链RNA病毒,是致犊牛腹泻的病毒。迄今为止,NeV已经在美国、英国、巴西、土耳其、日本等12个国家检出,具有广泛的地域分布。根据RdRp基因序列,NeV可以分为NB-like、NA1-like和Dijon A216-like 3种基因型;根据完整VP1序列,NeV可以分为2种基因型(基因1型和基因2型),其中基因1型又细分为4个谱系(谱系1)。目前,NeV在我国的存在及流行情况尚不清楚。本研究旨在调查NeV在我国的流行情况及其分子特征,取得了以下成果:1.我国部分地区奶牛NeV的分子检测和基因组研究采集新疆维吾尔自治区、四川省、辽宁省、河南省、山东省和陕西省23个养殖场的307份奶牛粪便样本(237份腹泻粪便样本,70份临床健康粪便样本),采用RT-PCR方法对NeV进行检测。结果显示,NeV在腹泻粪便样本的检出率(48.1%)显著高于健康粪便样本(5.70%,P<0.001),场阳性率为95.7%。6个省40株奶牛NeV RdRp基因片段之间的核苷酸相似性为91.8%00%,与Gen Bank中所有NeV RdRp基因片段的核苷酸相似性为75.6%0.0%。遗传进化分析显示,我国奶牛NeV毒株与NB-like毒株的遗传关系最近,但共同聚为独立的一大支,显示有共同的进化趋势。5个省28株奶牛NeV完整VP1之间的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为69.0%00%和73.2%00%,与Gen Bank中所有NeV VP1的核苷酸相似性和氨基酸的相似性分别为65.5%4.7%和69.9%8.7%。遗传进化分析显示,27株NeV毒株属于基因型1(21株为谱系1、4株为谱系3和2株为谱系4),剩余1株NeV毒株属于基因型2,表明我国奶牛NeV的VP1具有丰富的遗传多样性。成功获得Bo/LZB-1/CH/17毒株(基因2型)和Bo/YLA-2/17/CH毒株(基因1型谱系3)的完整基因组,其基因组大小均为7,453 bp。这2株NeV完整基因组之间的核苷酸相似性为88.9%,与已知的4株NeV基因组的核苷酸相似性为79.4%7.5%。基于P34、NTPase、P30、VPg、3CLpro和RdRp蛋白的遗传进化分析表明,Bo/LZB-1/CH/17毒株和Bo/YLA-2/17/CH毒株遗传关系最近,但这2株NeV的VP1遗传关系很远(Bo/LZB-1/CH/17毒株VP1属于基因2型,而Bo/YLA-2/17/CH毒株VP1属于基因1型谱系3)。重组分析揭示Bo/YLA-2/17/CH毒株VP1的P1A发生了重组事件,Bo/LZB-1/CH/17毒株RdRp的3’端发生了重组事件。本研究首次证实NeV在我国的存在并在奶牛中广泛流行,显示出独特的进化特征,为我国奶牛腹泻的诊断和防控提供了重要参考。首次获得VP1基因2型和基因1型谱系3的基因组,并首次鉴定NeV的VP1 P1A区域和RdRp 3’端的重组事件,对深入了解NeV的分子特征和遗传进化有重要意义。2.牦牛NeV的分子检测和基因组研究采集西藏自治区、四川省和云南省55个牧场的354份牦牛腹泻粪便样本,采用RT-PCR方法对NeV进行检测。结果显示,NeV的检出率为22.0%,场阳性率为69.1%。3个地区78株牦牛NeV RdRp基因片段之间的核苷酸相似性为63.1%00%,与Gen Bank中NeV RdRp基因片段的核苷酸相似性为62.4%7.2%。遗传进化分析显示,69株牦牛NeV毒株与我国奶牛中NeV毒株遗传关系最近,均为NB-like基因型;剩余9株牦牛NeV毒株共同聚为独立的一大支,区别于已知的NeV RdRp基因型,可能代表一种RdRp新基因型,建议命名为SC-Yak。2株具有潜在新RdRp基因型的NeV毒株(YAK/NRG-17/17/CH和YAK/HY1-2/18/CH毒株)的完整基因组被成功测序,其基因组大小分别为7,459 bp和7,460 bp,其5’-UTR分别为78bp和79 bp,3’-UTR均是66 bp。这2株牦牛NeV完整基因组之间的核苷酸相似性为90.2%,与Gen Bank中所有6个NeV基因组的核苷酸相似性仅为68.1%9.3%。分析其VP1序列也表明这2株牦牛NeV的VP1可能代表一种VP1新基因型,建议命名为基因3型。基于基因组、VP1、RdRp、VP2、P34、NTPase、P30、VPg和3CLpro蛋白的遗传进化分析均显示,YAK/NRG-17/17/CH毒株和YAK/HY1-2/18/CH毒株共同聚为独立的一个大支,代表一种新型NeV毒株

关键词： Nebovirus 奶牛牦牛分子检测基因组 real-time RT-PCR

柑橘木虱防控药剂筛选及矿物油对其增效作用评价

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2种核酸快提取法对羊口疮病毒和羊痘病毒DNA提取效能的比对研究

植物保护 2022年第2期48卷 247-254页

作者：胡双双戴素明张阳郭紫晶邓子牛李大志湖南农业大学园艺学院国家柑橘改良中心长沙分中心长沙 410128

为了筛选柑橘木虱高效防控药剂,提高药剂防治效果,本文探索了10种杀虫剂对柑橘木虱的田间防效及矿物油对杀虫剂的增效作用。结果表明:对柑橘木虱成虫,22%噻虫·高氯氟悬乳剂(SE)、70%吡虫啉可湿性粉剂(WP)、6%联菊·啶虫脒微乳剂(ME)和5... 详细信息

为了筛选柑橘木虱高效防控药剂,提高药剂防治效果,本文探索了10种杀虫剂对柑橘木虱的田间防效及矿物油对杀虫剂的增效作用。结果表明:对柑橘木虱成虫,22%噻虫·高氯氟悬乳剂(SE)、70%吡虫啉可湿性粉剂(WP)、6%联菊·啶虫脒微乳剂(ME)和5%高效氯氟氰菊酯ME的速效性好,药后1d防效94.61%~100%;22%噻虫·高氯氟SE、70%吡虫啉WP、10%氯噻啉WP和28%阿维·螺虫酯乳油(EC)的持效性好,药后7d防效75.97%~ 85.54%。对柑橘木虱若虫,22%噻虫·高氯氟SE和5%高效氯氟氰菊酯ME的速效性好,药后1d防效94.68%~ 94.93%;其中22%噻虫·高氯氟SE速效性和持效性均表现突出,药后7d防效达到100.00%。除22%噻虫·高氯氟SE外,70%吡虫啉WP、28%阿维·螺虫酯乳油也具有较好的持效性,药后7d防效85.50%~88.07%。矿物油分别与上述药剂混配,对70%吡虫啉WP和10%氯噻啉WP具有显著增效作用。综合考虑,建议田间防治柑橘木虱选用22%噻虫·高氯氟SE、70%吡虫啉WP、28%阿维·螺虫酯EC,使用吡虫啉时可与矿物油结合使用。

关键词：柑橘木虱田间试验矿物油防治效果

来源：博看期刊评论

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畜禽业 2023年第5期34卷 1-5,9页

作者：谭小雨杨洋郭紫晶李彦敏张志东西南民族大学畜牧兽医学院四川成都610041 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

目的合理选择病毒快速核酸提取方法。方法分别采用2种商品化核酸快提取法——Cell-to-cDNA裂解液(A法)和基于磁珠核酸提取方法(InnuPREP MP Basic Kit A,B法),提取羊临床样品中的羊口疮病毒(ORFV)和羊痘病毒(CaPV)核酸,使用实时荧光定... 详细信息

目的合理选择病毒快速核酸提取方法。方法分别采用2种商品化核酸快提取法——Cell-to-cDNA裂解液(A法)和基于磁珠核酸提取方法(InnuPREP MP Basic Kit A,B法),提取羊临床样品中的羊口疮病毒(ORFV)和羊痘病毒(CaPV)核酸,使用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)和重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(RPA-LFD)方法进行平行检测,并与常规核酸提取方法(宝生物病毒DNA/RNA提取试剂盒,C法)比较。结果与C法相比,在A法和B法提取的46份疑似orf拭子中,qPCR的ORFV核酸检出率分别为70.8%和87.5%,RPA-LFD的检出率分别为69.5%和82.6%;在A法和B法提取的52份疑似CaP的拭子样品中,qPCR的CaPV核酸检出率分别为77%和90%,RPA-LFD的检出率分别为65.5%和89.7%。对组织样品分析发现:A法不能用于组织样品的核酸提取;在B法提取的52份疑似orf组织样品核酸中,与C法相比,qPCR的ORFV核酸检出率为93.7%,RPA-LFD的检出率93.3%;对B法提取的61份疑似CaP组织样品核酸中,qPCR的CaPV核酸检出率为94.5%,RPA-LFD的检出率为88.7%。结论磁珠核酸提取方法(B法)可适用于不同样品中的ORFV和CaPV核酸的快速提取。

关键词：快速核酸提取试剂羊口疮羊痘 qPCR RPA-LFD