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我国实验用猪的健康管理与应用前景

畜牧与兽医 2024年第6期56卷 139-143页

作者：张磊甘源袁厅孙叶茂邵国青赵浩军冯志新江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室江苏南京210014 南京洲邦生物科技有限公司江苏南京210014 北京市动物疫病预防控制中心北京102629

猪在生理生化指标、解剖结构、系统功能、营养代谢以及疾病发生和发展等方面与人类机体相对应的系统和功能相类似。目前人医和动物医学领域各项研究中,越来越多研究者首选使用猪进行科学试验。本文将着重讨论我国当下实验用猪猪群的健... 详细信息

猪在生理生化指标、解剖结构、系统功能、营养代谢以及疾病发生和发展等方面与人类机体相对应的系统和功能相类似。目前人医和动物医学领域各项研究中,越来越多研究者首选使用猪进行科学试验。本文将着重讨论我国当下实验用猪猪群的健康管理,包括实验用猪猪群生物安全体系建立、生产管理、疫病监测机制、药物保健等,以提升实验用猪在饲养繁育和管理过程中的微生物等级与健康管理水平,减少其在实验过程中对科学实验造成的干扰。

关键词：实验用猪健康管理实验动物模型生物安全

基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 300-310页

作者：白昀谢青云欧阳伟甘源袁厅赵东明步志高邵国青冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建... 详细信息

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。

关键词：非洲猪瘟 sIgA抗体 ELISA 早期诊断

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猪腹膜间皮细胞的分离培养及初步应用

畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1249-1256页

作者：黄媛媛王佳陈嘉瑜甘源袁厅冯志新邵国青王先炜熊祺琰南京农业大学动物医学院南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学... 详细信息

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学、免疫学方法鉴定细胞。使用Mhr感染PMC细胞,观察细胞形态变化,并利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测细胞活性损伤情况。结果显示,倒置相差显微镜观察显示,分离培养的细胞早期呈拉网状,5~8 d后生长可达融合状态,细胞大小均一,呈多边形铺路石状;间接免疫荧光试验结果显示,细胞波形蛋白、角蛋白-18抗原呈阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原呈阴性;扫描电镜下可见细胞表面微绒毛。结果证实分离培养的细胞为猪PMC细胞,纯度达95%以上。Mhr感染后,光镜下可观察到细胞发生明显皱缩,感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高。本研究成功建立了猪原代PMC细胞的分离培养方法,并初步用于Mhr体外感染,为研究Mhr等引起浆膜炎的病原与宿主的互作机制提供了体外细胞模型。

关键词：腹膜间皮细胞原代培养猪猪鼻支原体

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶在诱导猪支气管上皮细胞凋亡中的作用

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畜牧兽医学报 2024年第5期55卷 2195-2205页

作者：王吉英尹蕊如谢星王海燕刘胡栋胡辉熊祺琰冯志新邵国青于岩飞湖南农业大学动物医学院长沙410125 江苏省农业科学院兽医研究所南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225327 怀化职业技术学院动物科技学院怀化418099 南京农业大学动物医学院南京210095 江苏省农业科学院动物免疫工程研究所南京210014 湖南医药学院医学人文与信息管理学院怀化418000

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, L... 详细信息

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)不仅参与猪肺炎支原体的代谢还与猪肺炎支原体的毒力相关。因此,本研究通过原核表达及亲和层析获得猪肺炎支原体乳酸脱氢酶重组蛋白(recombinant LDH, rLDH),之后分别用不同浓度的rLDH与猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cell, PBEC)孵育,经显微镜观察rLDH对细胞形态的影响,通过CCK-8法检测rLDH对细胞活力的影响。选取对细胞形态及活力影响不显著的50和100μg·mL^(-1) rLDH分别与PBEC孵育,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,反转录荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法和免疫印记检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的转录水平和蛋白水平。结果显示:猪肺炎支原体rLDH呈剂量依赖性地诱导PBEC凋亡,其作用与猪肺炎支原体菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后,PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的mRNA水平显著下调,caspase 8的mRNA水平未发生显著变化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表达水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表达水平显著下调。结果表明,猪肺炎支原体可能通过LDH诱导PBEC内源性细胞凋亡,凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。

关键词：猪肺炎支原体(Mhp) 乳酸脱氢酶(LDH) 猪支气管上皮细胞(PBEC) 凋亡

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猪肺炎支原体LAP的结构预测及其抑制剂Bestatin对支原体生长的影响

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 1-11页

作者：陈蓉郝飞谢星赵琳韦艳娜张磊王丽熊琪琰邵国青冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和... 详细信息

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。本研究拟以猪肺炎支原体(Mhp)LAP为模型,研究其理化特性和高级结构,探索LAP抑制剂乌苯美司(Bestatin)对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较,分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白,通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白,圆二色谱测定LAP的二级结构,用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高,但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后,分子筛层析显示LAP是六聚体,圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制,且呈现剂量依赖性,但在不同菌株间存在差异,最低在6μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供了新的思路。

关键词：猪肺炎支原体亮氨酸氨肽酶结构活性位点

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猪鼻支原体临床分离株体外抗生素敏感性研究

中国兽医科学 2024年第4期54卷 553-559页

作者：邵佳韦艳娜王佳李俊黄媛媛华利忠甘源刘蓓蓓冯志新邵国青王先炜熊祺琰南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300

为探究猪鼻支原体(Mhr)临床分离株对常见抗生素的敏感性,利用微量肉汤稀释法检测12种临床常见支原体病治疗用抗生素对本实验室2010-2021年间分离得到的31株Mhr临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示:Mhr临床分离菌株对泰妙菌素最为敏... 详细信息

为探究猪鼻支原体(Mhr)临床分离株对常见抗生素的敏感性,利用微量肉汤稀释法检测12种临床常见支原体病治疗用抗生素对本实验室2010-2021年间分离得到的31株Mhr临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示:Mhr临床分离菌株对泰妙菌素最为敏感,其MIC_(50)为0.030μg/mL,MIC_(90)为0.125μg/mL;对多西环素与环丙沙星也较为敏感,MIC_(50)和MIC_(90)值均为0.50和1.00μg/mL;对泰乐菌素和泰万菌素的MIC呈现双峰分布;对替米考星和林可霉素的MIC_(90)值均达到≥128μg/mL,分别有29%和32%的菌株MIC≥128μg/mL,出现了明显的耐药趋势。本研究结果丰富了我国Mhr临床菌株的药物敏感性数据,为临床用药提供了数据支撑及合理指导。

关键词：猪鼻支原体临床分离株药物敏感性

滑液支原体烯醇化酶在感染宿主中的反应原性和细胞黏附性

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中国兽医学报 2024年第1期44卷 88-96页

作者：徐彬孙玉王树于岩飞王晓丽马孙婷孙华伟张敬峰刘传敏吕立新冯志新熊祺琰邵国青张小飞欧阳伟江苏省农业科学院兽医研究所国家兽用生物制品工程技术研究中心/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300 江苏大学生命科学学院江苏镇江212013 江苏大学医学院江苏镇江212013 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase,Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白... 详细信息

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase,Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白结合位点和B细胞表位。MS Eno在不同MS菌株间同源性较高,且有别于其他物种。B细胞表位广泛分布在Eno蛋白的各个部分,且大都与预测的蛋白结合位点有重合。进行Eno原核表达和纯化,制备兔抗Eno多克隆抗血清。利用Western blot分析Eno在MS感染鸡或灭活苗免疫鸡中的反应原性。结果显示,MS Eno与兔抗Eno多克隆抗血清、兔抗MS多克隆抗血清、灭活疫苗(HN01株或YBF-MS1株)高免鸡血清、HN01强毒攻毒后阳性鸡血清、3个不同地方来源的临床阳性鸡血清均能发生反应,说明其在疫苗免疫和病原感染鸡中均表现有反应原性。利用菌落印迹和双荧光检测分析并证实Eno为外膜蛋白。利用间接免疫荧光和ELISA板结合试验分析Eno对鸡滑膜鞘细胞(synovial sheath cells,SSCs)是否具有黏附素作用。试验证实Eno对SSCs具有黏附作用,且此黏附作用具有Eno浓度依赖性。以上证明MS Eno在病原感染和灭活苗免疫鸡中具有反应原性,并作为外膜锚定的细胞黏附素参与对关键宿主细胞SSCs的黏附,为后续深入研究Eno的致病和免疫相关功能提供了重要参考。

关键词：滑液支原体烯醇化酶反应原性细胞黏附

博落回提取物和抗生素联合用药对蛋种鸡自然感染滑液囊支原体的治疗效果分析

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畜牧兽医学报 2023年第11期54卷 4827-4838页

作者：王晨燕周峰邵国青侯博福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病疾病防治工程技术研究中心福州350013 佛山科学技术学院生命科学与工程学院佛山528231 江苏省农业科学院兽医研究所南京210014

旨在分析博落回提取物和抗生素联合用药对蛋种鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synovia,MS)自然感染病例的治疗效果。选取80只124日龄的海兰褐父母代蛋种鸡,随机分为博落回提取物组(G1)、无处理组(G2)、盐酸多西环素+博落回提取物组(G3)、林... 详细信息

旨在分析博落回提取物和抗生素联合用药对蛋种鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synovia,MS)自然感染病例的治疗效果。选取80只124日龄的海兰褐父母代蛋种鸡,随机分为博落回提取物组(G1)、无处理组(G2)、盐酸多西环素+博落回提取物组(G3)、林可-大观霉素+博落回提取物组(G4)、酒石酸泰乐菌素+博落回提取物组(G5)、酒石酸泰万菌素+博落回提取物组(G6)、磷酸替米考星+博落回提取物组(G7)、延胡索酸泰妙菌素+博落回提取物组(G8)。G2组正常饮食和饮水,其余各组饲料中全程添加博落回提取物,此外G3~G8组通过饮水进行抗生素给药,连续使用5 d,停3 d后,再使用5 d。各组在用药前以及用药后第17天、第24天、第38天和第59天分别采集上颚裂拭子,并在用药后第59天采集输卵管膨大部和子宫部拭子进行MS病原荧光定量PCR检测。各组在用药前以及用药后第17天、第31天和第59天分别采血进行MS抗体检测。在用药后第59天剖检观察并统计包括气囊炎、脚垫肿胀和输卵管炎的发病率,同时采集气管、输卵管膨大部和子宫部固定并进行病理损伤观察。开产后,统计6周的周日均产蛋数,并测定各组第4、5和6周的蛋品质。结果显示:1)MS病原检测结果表明:用药后第17天和第24天,G4组的上颚裂拭子MS载量相较于G2组分别极显著和显著下降(P<0.001和P<0.01),用药后第17天,G6和G7组的上颚裂拭子MS载量相较于G2组显著下降(P<0.01);在用药后第17天和第24天,用药组上颚裂拭子的MS病原阳性率(G3和G5组除外)均下降,在用药后第59天,用药组(G4、G6和G8组除外)阳性率都恢复到用药前水平;G2和G8组的输卵管膨大部中MS病原阳性率为20%,G4、G5和G7组的阳性率均为10%,而G1、G3和G6组的输卵管膨大部以及各组子宫部均未检测到MS病原。2)MS抗体检测结果表明:G1和G4组用药后第59天抗体平均滴度较用药前下降60%左右。3)病理损伤观察发现:各组鸡用药前后气管均表现为不同程度的炎性细胞浸润,输卵管未发现任何病理损伤。4)蛋品质测定结果表明:G1、G3、G4和G6组开产后的周日均产蛋量都较G2组高;G8组开产后第4周的平均蛋重显著低于G2组(P<0.01),其余各组均未发现有显著差异;G4组在产蛋后第6周的中蛋(53

关键词：滑液囊支原体抗生素博落回药物治疗

2021年华东地区鸡传染性支气管炎病毒分离、鉴定及S1基因遗传特征分析

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中国动物传染病学报 2022年

作者：蓝胜芝侯博邵国青王晨燕浙江诗华诺倍威生物技术有限公司江苏省农业科学院兽医研究所福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病疾病防治工程技术研究中心

本研究在2021年从华东地区肉鸡或蛋鸡群中采集了187份具有呼吸道症状的患病鸡气管、肺脏和肾脏混合样本，通过鸡胚分离、RT-PCR和基因测序等方法分离鉴定出IBV，并对其S1基因测序，通过构建系统进化树进行遗传进化分析。结果显示：187...

本研究在2021年从华东地区肉鸡或蛋鸡群中采集了187份具有呼吸道症状的患病鸡气管、肺脏和肾脏混合样本，通过鸡胚分离、RT-PCR和基因测序等方法分离鉴定出IBV，并对其S1基因测序，通过构建系统进化树进行遗传进化分析。结果显示：187份临床病料中检测出79份阳性样品，将其接种SPF鸡胚共分离鉴定出39株IBV，S1进化树分析结果表明主要流行的基因型为GI-19，GI-13，tl/CH/LDT3/03型和GVI，其中GI-19为优势基因型，其次是GI-13。本研究初步明确了华东地区2021年IBV分离株的遗传进化特点，对IBV临床防控具有重要的参考意义。

关键词：