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一种小鼠睾丸细胞涂片的快速制备方法

细胞与分子免疫学杂志 2014年第2期30卷 202-205页

作者：杨梦左笑丛李艳黄利华邢晓为中南大学湘雅三医院药学部湖南长沙410013 中南大学药学院湖南长沙410013 中南大学湘雅三医院医学实验中心湖南长沙410013

目的建立一种用于免疫荧光实验的小鼠睾丸细胞涂片的快速制备新方法。方法分别给出生后16、21、28 d和120 d的小鼠腹腔注射秋水仙素,3 h后取睾丸组织剔除白膜,分离曲精小管进行剪碎,加入冷PBS重悬细胞,过滤,并用冷PBS洗涤细胞3次,然后... 详细信息

目的建立一种用于免疫荧光实验的小鼠睾丸细胞涂片的快速制备新方法。方法分别给出生后16、21、28 d和120 d的小鼠腹腔注射秋水仙素,3 h后取睾丸组织剔除白膜,分离曲精小管进行剪碎,加入冷PBS重悬细胞,过滤,并用冷PBS洗涤细胞3次,然后低渗处理,最后经多聚甲醛固定后铺片。对细胞核进行DAPI染色,并以21 d小鼠睾丸涂片为例进行免疫荧光实验,检测所制备的细胞涂片的质量。结果所制备的小鼠睾丸细胞涂片经DAPI染色,每张细胞涂片均分布大量生殖细胞,背景清晰,根据细胞核的大小与着色,可初步判断生殖细胞类型;用不同发育阶段小鼠所制备的睾丸细胞涂片,细胞分布类型有很大差异,其中28 d小鼠制备的睾丸细胞涂片中生殖细胞类型最多;以21 d小鼠睾丸细胞涂片为例进行免疫荧光实验,红色和绿色荧光标记的目标蛋白在精母细胞中表达清晰,背景干净,说明所制备的细胞涂片适合于免疫荧光检测。结论成功建立了一种快速制备小鼠睾丸细胞涂片的新方法。

关键词：小鼠睾丸细胞涂片低渗处理免疫荧光技术精子发生

RBM5基因表达载体构建、稳定转染A549细胞系的建立及功能的初步研究

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中南大学学报（医学版） 2014年第10期39卷 994-1000页

作者：肖锏李念邢晓为何碧秀中南大学湘雅医院老年病科长沙410008 中南大学湘雅三医院医学科研中心长沙410013

目的:通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系,初步研究RBM5基因过表达对A549细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表达的影响。方法:应用分段克隆法构建... 详细信息

目的:通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系,初步研究RBM5基因过表达对A549细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表达的影响。方法:应用分段克隆法构建pc DNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pc DNA3.1(+)/RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别检测经pc DNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pc DNA3.1(+)/RBM5-A549]及pc DNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞[pc DNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pc DNA3.1(+)/RBM5-A549和pc DNA3.1(+)-A549细胞中剪接相关因子DHX15的表达情况。结果:成功构建出pc DNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过表达阳性细胞株;pc DNA3.1(+)/RBM5-A549较pc DNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均P<0.01);c DNA3.1(+)/RBM5-A549较pc DNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论:成功构建重组质粒pc DNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细胞周期,并使DHX15表达上调。

关键词： RNA结合基序5 A549细胞系天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15 基因克隆质粒构建肿瘤抑制细胞周期

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SOD1真核表达载体的构建及表达

细胞与分子免疫学杂志 2010年第10期26卷 962-965页

作者：吴雄辉孙虹邢晓为黄利华中南大学湘雅三医院耳鼻咽喉头颈外科湖南长沙410013 中南大学湘雅三医院医学实验中心湖南长沙410013

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因真核表达载体,并在HeLa细胞中进行表达。方法:应用RT-PCR从人外周血中扩增SOD1基因开放阅读框(ORF),采用TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm-T-SOD1。随后,... 详细信息

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因真核表达载体,并在HeLa细胞中进行表达。方法:应用RT-PCR从人外周血中扩增SOD1基因开放阅读框(ORF),采用TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm-T-SOD1。随后,将SOD1进一步克隆到真核表达载体pTracer-CMV/Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pTracer-CMV/Bsd-SOD1质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,转染HeLa细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选4周,用RT-PCR、Western blot检测SOD1的表达。结果:成功构建了pTracer-CMV/Bsd-SOD1真核表达质粒,转染HeLa细胞,发现转染成功的细胞均发绿色荧光;RT-PCR及Western blot检测结果表明,所转染的SOD1在HeLa细胞中成功表达。结论:成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和SOD1的真核表达质粒pTracer-CMV/Bsd-SOD1,为进一步研究SOD1在基因治疗中的作用奠定了基础。

关键词：铜锌超氧化物歧化酶载体构建基因转染基因表达基因治疗

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小鼠睾丸生精新基因SRG4原核表达与纯化

细胞与分子免疫学杂志 2007年第8期23卷 701-703页

作者：邢晓为袁洪王维中南大学湘雅三医院细胞移植与基因治疗中心湖南长沙410013

目的：原核表达小鼠睾丸生精新基因SRG4, 并对重组蛋白进行纯化, 为研究SRG4的生物学功能奠定基础.方法：应用RT-PCR从小鼠睾丸中扩增SRG4 C端包含一个Sad1_UNC like domain的587 bp片段, 将PCR产物克隆至pUCm-T载体.随后, cDNA片段亚... 详细信息

目的：原核表达小鼠睾丸生精新基因SRG4, 并对重组蛋白进行纯化, 为研究SRG4的生物学功能奠定基础.方法：应用RT-PCR从小鼠睾丸中扩增SRG4 C端包含一个Sad1_UNC like domain的587 bp片段, 将PCR产物克隆至pUCm-T载体.随后, cDNA片段亚克隆至带有6个组氨酸标签的原核表达载体PQE-30中, 测序鉴定.将重组质粒PQE-30-SRG4转化大肠杆菌M15, IPTG诱导, 表达产物以Western blot进行鉴定, 并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化.结果：成功地构建了原核表达质粒PQE-30-SRG4.IPTG诱导4 ～5 h, SRG4融合蛋白表达量达最高.Western blot分析证实, IPTG诱导表达的蛋白是SRG4融合蛋白.Ni-NTA Agarose纯化后得到较纯的SRG4融合蛋白.结论：重组质粒PQE-30-SRG4能在大肠杆菌M15中表达, 包含Sad1_UNC like domain的纯化SRG4融合蛋白可用于研究SRG4在精子发生中的生物学功能.

关键词： SRG4 克隆原核表达融合蛋白精子发生

β1肾上腺素能受体表达变化对血压影响的研究进展

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中国临床药理学杂志 2014年第7期30卷 653-656页

作者：夏雷袁洪邢晓为中南大学湘雅三医院药剂科长沙410013 中南大学湘雅三医院临床药理中心长沙410013 中南大学湘雅三医院医学实验中心长沙410013

β1肾上腺素能受体(β1-AR)下调β1-AR的表达或者β1-AR基因敲除,能有效地降低自发性高血压大鼠的血压。β1-AR上调能增加心率,引发心律失常,也能诱导高血压等心血管疾病。本文主要研究β1-AR的表达差异对心血管系统以及血压的影响,了解... 详细信息

β1肾上腺素能受体(β1-AR)下调β1-AR的表达或者β1-AR基因敲除,能有效地降低自发性高血压大鼠的血压。β1-AR上调能增加心率,引发心律失常,也能诱导高血压等心血管疾病。本文主要研究β1-AR的表达差异对心血管系统以及血压的影响,了解β1-AR和β1-AR基因的功能以及β1-AR与血压变化的相互关系。

关键词： β1肾上腺素能受体高血压 β1-AR基因敲除危险因素

人睾丸蛋白SPAG4L与KASH结构域蛋白Nesprin-3的相互作用

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临床检验杂志 2017年第3期35卷 221-225页

作者：任瑶伍勇黄利华邢晓为中南大学湘雅三医院医学实验中心长沙430013 中南大学湘雅三医院检验科长沙430013

目的探讨含SUN(Sad,UNC-84)结构域的人睾丸蛋白SPAG4L(sperm-associated antigen 4 like)与具有KASH(Klarsicht,ANC-1 and Syne homology)结构域的核膜血影重复蛋白3(nuclear envelop spectrin repeat proteins 3,Nesprin-3)之间的相互作用。方法用生物信息学方法对SPAG4L蛋白进行分析,通过体外转染实验,观察SPAG4L的亚细胞定位;并用免疫荧光技术、免疫共沉淀和双分子荧光互补实验检测SPAG4L是否与KASH结构域蛋白Nesprin-3存在相互作用。结果生物信息学分析结果表明,SPAG4L蛋白具有跨膜结构;亚细胞定位结果发现,SPAG4L蛋白定位于核膜和胞浆;免疫荧光、免疫共沉淀和双分子荧光互补实验结果表明,SPAG4L蛋白与Nesprin-3蛋白质相互作用,形成LINC(linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton)复合物。结论 SPAG4L与Nesprin-3能够相互作用,形成LINC复合物,对了解SPAG4L蛋白在精子发生中的作用具有重要的意义。

关键词： SPAG4L 核膜血影重复蛋白3 相互作用 LINC复合物精子发生

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人睾丸新基因SPAG4L的原核表达与纯化

南方医科大学学报 2010年第9期30卷 2047-2050页

作者：蒋先镇杨明刚邢晓为中南大学湘雅三医院泌尿外科湖南长沙430013 中南大学湘雅三医院医学实验中心湖南长沙430013

目的原核表达人睾丸生精相关基因SPAG4L,并对重组蛋白进行纯化,为下一步研究SPAG4L的生物学功能奠定基础。方法运用RT-PCR从人睾丸中扩增编码SPAG4L126-379的基因片段,并将PCR产物克隆至pUCm-T载体。用限制性内切酶EcoR I和Hind III消化... 详细信息

目的原核表达人睾丸生精相关基因SPAG4L,并对重组蛋白进行纯化,为下一步研究SPAG4L的生物学功能奠定基础。方法运用RT-PCR从人睾丸中扩增编码SPAG4L126-379的基因片段,并将PCR产物克隆至pUCm-T载体。用限制性内切酶EcoR I和Hind III消化后,将目的片段克隆至带有6个组氨酸标签的原核表达载体PQE30中。重组质粒PQE-30-SPAG4L经酶切和测序验证后,转化大肠杆菌JM15,IPTG诱导融合蛋白表达。SPAG4L融合蛋白以westernblot进行鉴定,最后用NI-NTA磁性琼脂糖珠进行纯化。结果成功构建了重组表达质粒PQE-30-SPAG4L,并能够在大肠杆菌JM15中诱导表达,经Western blot分析证实,IPTG诱导表达的是SPAG4L融合蛋白。建立小规模的SPAG4L融合蛋白表达、纯化系统,获得了带有6个组氨酸标签的纯化的SPAG4L融合蛋白。结论成功地对人睾丸生精相关基因SPAG4L进行了体外原核表达,获得了纯化的融合蛋白蛋白,为进一步研究该蛋白在精子发生中的生物功能奠定了基础。

关键词： SPAG4L 克隆原核表达融合蛋白

人TSARG4真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第8期25卷 684-687页

作者：杨幼波向红邢晓为中南大学湘雅三医院内分泌科湖南长沙410013 中南大学湘雅三医院医学实验中心湖南长沙410013

目的:构建人TSARG4基因真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染TSARG4的HeLa细胞系。方法:应用RT-PCR从人睾丸中扩增TSARG4的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到pUCm-T载体中测序验证。随后,将TSARG4进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达... 详细信息

目的:构建人TSARG4基因真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染TSARG4的HeLa细胞系。方法:应用RT-PCR从人睾丸中扩增TSARG4的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到pUCm-T载体中测序验证。随后,将TSARG4进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中。用脂质体将经过测序、验证的pcDNA3.1(+)/TSARG4质粒转染HeLa细胞,通过G418筛选建立TSARG4稳定转染的HeLa细胞系。RT-PCR和组织原位杂交技术检测TSARG4在稳定转染的HeLa细胞系中的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(+)/TSARG4表达质粒,建立了稳定转染的HeLa细胞系。RT-PCR和组织原位杂交检测结果表明,TSARG4基因在该细胞系中成功表达。结论:TSARG4真核表达载体成功构建和稳定转染HeLa细胞系的建立为进一步体外研究TSARG4的功能奠定了基础。

关键词： TSARG4 基因表达转染 RT-PCR 组织原位杂交

不同方法转染AAV9-CMV-ZsGreen基因对大鼠心肌组织有效性及安全性比较实验研究

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不同方法转染AAV9-CMV-ZsGreen基因对大鼠心肌组织有效性及安全性...