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丹参Salvia miltiorrhiza叶片快速成苗遗传转化体系研究

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分子植物育种 2024年

作者：孙素洁夏心语赵岩秋李海阳赵立子鲁东大学农林工程研究院鲁东大学农学院

丹参是中国大宗常用中药材之一，在全国大部分地区均有分布。丹参种质复杂，且易产生变异类型特征使得丹参品种选育工作严重制约丹参产业的发展。为此，高效和稳定的再生体系建立和遗传转化体系优化是丹参生产和研究中必不可少的基础。... 详细信息

丹参是中国大宗常用中药材之一，在全国大部分地区均有分布。丹参种质复杂，且易产生变异类型特征使得丹参品种选育工作严重制约丹参产业的发展。为此，高效和稳定的再生体系建立和遗传转化体系优化是丹参生产和研究中必不可少的基础。本研究利用山东丹参作为研究材料，建立和构建了丹参叶片快速成苗法再生体系与稳定的根癌农杆菌遗传转化体系，为定向分子设计育种奠定基础。丹参再生体系建立阶段，采用不定芽分化培养基（MS519 2.4 g/L+MES 0.5 g/L+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂7 g/L），能够直接诱导丹参叶片产生大量不定芽，且相比愈伤组织诱导法缩短20 d以上。遗传转化研究发现，在菌液浓度OD600=0.8，侵染时间10 min条件下，叶片快速成苗法进行丹参遗传转化的阳性不定芽出芽效率最高。研究结果对丹参叶片快速成苗法遗传转化体系的建立，大幅度提高了丹参叶片不定芽诱导效率与农杆菌遗传转化效率，为丹参基因功能研究与分子育种的开展奠定基础。

关键词：丹参叶片快速成苗组织培养遗传转化

杨树糖基转移酶GT14基因家族分析及响应盐胁迫基因的筛选

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分子植物育种 2024年第6期22卷 1741-1750页

作者：张一凡宣灵灵卢孟柱赵岩秋曾为浙江农林大学林业与生物技术学院亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

木材的形成基于维管形成层细胞的分裂分化,其中次生壁加厚是关键步骤。研究表明,植物在盐胁迫下细胞壁的组分与结构将发生变化,其中细胞壁表面的多糖阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan protein,AGP)起重要作用。AGP糖链是由糖基转移酶(gly... 详细信息

木材的形成基于维管形成层细胞的分裂分化,其中次生壁加厚是关键步骤。研究表明,植物在盐胁迫下细胞壁的组分与结构将发生变化,其中细胞壁表面的多糖阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan protein,AGP)起重要作用。AGP糖链是由糖基转移酶(glycosyltransferase, GT)催化合成,在细胞壁的生物合成中起关键作用,而且其表达量变化直接影响木质部的发育。本研究通过对杨树GT14 (Glycosyltransferase family14)家族进化关系与基因结构分析发现该家族基因在进化上具有较强的保守性。同时,3个杨树GT14基因在盐胁迫下表达量上调,且其中2个基因在体外表现出GlcAT活性。启动子元件分析发现这3个基因均包含多个非生物胁迫响应元件。本研究分析了杨树GT14基因功能,并为提高木本植物非生物耐逆作用提供线索。

关键词：杨树 GT14 进化分析盐胁迫

杨树愈伤组织转化体系优化及PtKNLPa遗传转化

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分子植物育种 2022年

作者：张炜林赵岩秋卢孟柱浙江农林大学林业与生物技术学院

杨树作为木本植物模式植物，其遗传转化体系的完善对木本植物基因功能的研究与杨树基因工程育种至关重要。本研究以84K (Populus alba× P. glandulosa)杨树叶片为试验材料，首先分析了不同激素配比对愈伤组织诱导的影响，结果表明84K... 详细信息

杨树作为木本植物模式植物，其遗传转化体系的完善对木本植物基因功能的研究与杨树基因工程育种至关重要。本研究以84K (Populus alba× P. glandulosa)杨树叶片为试验材料，首先分析了不同激素配比对愈伤组织诱导的影响，结果表明84K杨树叶片愈伤诱导的最佳培养基为C1培养基：MS+2.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)+0.1 mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)+0.2 mg/L萘乙酸(NAA)+20 g/L蔗糖+4 g/L植物凝胶。随后，基于本课题组前期关于PtKNLPa (KNOTTED-like from Populus a)基因的研究，将其编码序列构建至pK2GW7-eYGFP可视化表达载体上进行遗传转化，对愈伤组织为受体的转化体系进行优化。优化过程中，本研究主要通过调整愈伤组织侵染时间及菌液浓度(OD代表菌液浓度)，借助荧光信号对转化后的愈伤组织转化效率与阳性出芽率进行统计分析。结果表明，两因素不同梯度组合中，菌液OD=0.6与侵染10 min为最佳侵染组合，此组合下愈伤组织转化效率与出芽率分别为79.26%与70.83%。最后从最终获得的候选植株中随机选取十株进行DNA水平与转录水平检测，DNA水平检测显示这十株候选植株均为阳性植株，qRT-PCR分析发现此十株阳性植株PtKNLPa的表达均有不同程度的增加。本研究对84K杨树叶片愈伤组织诱导培养基的选择及以愈伤组织为受体的遗传转化方法的优化，大幅度提高了杨树叶片愈伤组织诱导效率与农杆菌介导的遗传转化效率，为杨树基因功能的研究与分子育种的开展提供了手段。

关键词： 84K愈伤组织遗传转化植物激素菌液浓度侵染时间

转录因子PagKNAT2/6b影响杨树韧皮纤维发育

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分子植物育种 2022年

作者：石洋鑫赵岩秋卢孟柱浙江农林大学林业与生物技术学院

韧皮纤维作为一种重要的植物纤维，具有较好的力学性能和环境友好性。植物韧皮纤维不仅支撑植物的茎与枝，而且以其优越的性能和环保特性在高档纸张与纺织品的制作中占有重要位置，韧皮纤维来源于次生韧皮部的发育，其调控研究尚未见报... 详细信息

韧皮纤维作为一种重要的植物纤维，具有较好的力学性能和环境友好性。植物韧皮纤维不仅支撑植物的茎与枝，而且以其优越的性能和环保特性在高档纸张与纺织品的制作中占有重要位置，韧皮纤维来源于次生韧皮部的发育，其调控研究尚未见报道。本课题组前期研究发现，杨树KNOX (KNOTTED-like homeobox gene)家族基因PagKNAT2/6b特异在木质部与韧皮部表达，由此推测其不仅参与调控木质部分化及木质部纤维与导管的细胞壁沉积，而且可能影响韧皮部的发育。本研究结合PagKNAT2/6b异常表达的转基因杨树茎的解剖学与转录组学分析，探究PagKNAT2/6b在杨树韧皮纤维发育中的作用机制。首先，通过解剖学分析发现过表达PagKNAT2/6b植株(OE5与OE7)抑制了幼嫩节间韧皮部韧皮纤维的分化，而促进了成熟节间韧皮纤维的分化，但韧皮纤维长度显著缩短。相反地，PagKNAT2/6b融合SRDX结构域的显性抑制转基因杨树(SRDX1与SRDX20)在幼嫩节间表现出促进韧皮纤维分化的特点，而基部节间抑制韧皮纤维形成，但韧皮纤维长度显著增长。结合PagKNAT2/6b过表达转基因材料茎的RNA-seq数据和Aspwood基因表达在线数据，筛选出9个特异在韧皮部中高表达且与韧皮部发育相关的关键差异表达基因，并通过qRT-PCR实验对其进行了验证。综上所述，杨树PagKNAT2/6b通过调控韧皮部发育相关的关键转录因子参与调控韧皮纤维的发育，并为植物定向改良韧皮纤维的分子育种工作提供了依据。

关键词： PagKNAT2/6b 杨树韧皮纤维调控机制

DNA拓扑异构酶基因PagTOP2b对银腺杨‘84K’生长发育的影响

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浙江农林大学学报 2022年第6期39卷 1155-1162页

作者：郭雅琨赵岩秋杜娟卢孟柱浙江农林大学林业与生物技术学院省部共建亚热带森林培育国家重点实验室浙江杭州311300 浙江大学生命科学学院浙江杭州310058

【目的】DNA拓扑异构酶基因是一类能够改变DNA拓扑结构的酶,在基础生命活动如DNA复制、转录、有丝分裂等过程中发挥重要作用。研究DNA拓扑异构酶基因对杨树Populus生长发育的影响,能够进一步了解DNA拓扑异构酶基因在木本植物中的作用机... 详细信息

【目的】DNA拓扑异构酶基因是一类能够改变DNA拓扑结构的酶,在基础生命活动如DNA复制、转录、有丝分裂等过程中发挥重要作用。研究DNA拓扑异构酶基因对杨树Populus生长发育的影响,能够进一步了解DNA拓扑异构酶基因在木本植物中的作用机制,评估其是否可作为林木分子育种的靶标。【方法】从银腺杨‘84K’ Populus alba×P. glandulosa ‘84K’(84K杨)中克隆得到DNA拓扑异构酶基因PagTOP2b,利用生物信息学方法对其进行序列分析、蛋白理化性质及结构分析。实时荧光定量PCR分析PagTOP2b在杨树不同组织中的表达水平。利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的叶盘转化法转化84K杨,得到PagTOP2b过表达转基因植株。通过表型及茎段切片分析过表达PagTOP2b基因对84K杨植株生长的影响。【结果】以84K杨cDNA为模板,克隆得到PagTOP2b基因全长序列,该基因蛋白质编码区(CDS)长度为4 449 bp,编码1 482个氨基酸,根据蛋白结构域分析属于ⅡA型DNA拓扑异构酶。PagTOP2b主要在杨树幼嫩组织中有较高的表达量。过量表达PagTOP2b基因会导致转基因植株高度、基部节间直径和木质部宽度显著增加。【结论】DNA拓扑异构酶作为一类参与基础生命活动的重要功能酶,在杨树中过量表达ⅡA型DNA拓扑异构酶基因PagTOP2b可促进植株的纵向及径向生长,增加植株生物量。图4表1参28。

关键词： DNA拓扑异构酶银腺杨‘84K’ 过量表达生物量

84K杨PagMSBP1/2a基因对木质素合成的影响

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林业科学 2022年第6期58卷 56-65页

作者：胥雅静王佳伟赵岩秋江成黄李超安轶曾为张进卢孟柱浙江农林大学林业与生物技术学院省部共建亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

【目的】膜类固醇结合蛋白(MSBP)是一类定位在细胞质膜上的类固醇受体蛋白,通过响应激素调节信号、参与类固醇代谢影响植物生长发育过程。研究杨树MSBP对生长发育过程的影响,尤其是对木材形成过程的作用,为杨树木材品质改良提供支撑。... 详细信息

【目的】膜类固醇结合蛋白(MSBP)是一类定位在细胞质膜上的类固醇受体蛋白,通过响应激素调节信号、参与类固醇代谢影响植物生长发育过程。研究杨树MSBP对生长发育过程的影响,尤其是对木材形成过程的作用,为杨树木材品质改良提供支撑。【方法】以拟南芥MSBP1蛋白序列在毛果杨、银腺杨84K基因组中进行同源序列比对,获取杨树MSBP的核苷酸和氨基酸序列,构建系统进化树并绘制基因结构图谱;利用qPCR分析杨树MSBP基因在84K杨顶芽、根、茎、叶中的相对表达量;在AspWood表达谱数据中分析同源基因在木材形成中的表达模式;构建35 S∷GFP-PagMSBP1/2a植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化烟草叶片,激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位情况;构建35 S∷PagMSBP1/2a植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化84K杨,通过震荡切片观察转基因和对照植株茎段木质部差异;采用乙酰溴法和间苯三酚染色法,分析转基因和对照植株的木质素含量以及木质素在杨树茎段维管组织中的分布。【结果】同源比对鉴定出杨树7个MSBP成员,根据进化关系和基因结构对杨树基因进行命名,其中与AtMSBP1、AtMSBP2同源基因分别命名为PtMSBP1/2a、PtMSBP1/2b和PtMSBP1/2c,PtMSBP1/2a与AtMSBP1同源性最高;qPCR结果显示,在根、茎和叶中3个基因均有表达,PagMSBP1/2c的表达量显著低于其他2个基因,PagMSBP1/2a在木质化程度高的老茎(6~8节间)中表达量最高,均为木质化低的幼茎(1~3节间)的6倍,与AspWood数据库所显示的PtMSBP1/2a在木材形成过程中表达量较高且在木质部高表达一致。克隆84K杨的MSBP1/2a(PagMSBP1/2a),其编码的蛋白在N端含有跨膜结构域,亚细胞定位分析表明PagMSBP1/2a定位于内质网膜。构建PagMSBP1/2a超表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化84K杨树获得转基因植株,转基因植株生长变缓,株高矮于对照;PagMSBP1/2a过表达的植株木质素含量显著低于未转基因对照,乙酰溴可溶性木质素含量降低高达34.6%。【结论】杨树PagMSBP1/2a是定位在内质网膜上的类固醇受体蛋白,参与调控杨树木材形成过程中木质素的生物合成过程,可作为靶基因进行木质素含量调控。

关键词： PagMSBP1/2a基因银腺杨84K 亚细胞定位过量表达木质素

杨树GRF1/2d负调控不定根的发生和发育

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林业科学 2017年第3期53卷 33-39页

作者：周厚君魏凯莉江成赵岩秋宋学勤卢孟柱林木遗传育种国家重点实验室中国林业科学研究院林业研究所北京100091

【目的】生长调节因子(GRFs)是一类植物特有的转录因子,调控植物生长发育的多个生物学过程。研究杨树组织和器官发育中GRFs的作用,尤其是对不定根形成的调控,不仅可以丰富根发育的理论,而且对于杨树的扦插繁殖具有实际应用价值。【方法... 详细信息

【目的】生长调节因子(GRFs)是一类植物特有的转录因子,调控植物生长发育的多个生物学过程。研究杨树组织和器官发育中GRFs的作用,尤其是对不定根形成的调控,不仅可以丰富根发育的理论,而且对于杨树的扦插繁殖具有实际应用价值。【方法】从银腺杨84K中分离了PtGRF1/2d基因和其启动子,通过对其miR396靶位点核苷酸进行同义突变,获得不受miR396调控的突变形式的mPtGRF1/2d,并将启动子和该突变形式分别构建至含有GUS报告基因的植物表达载体和过量表达载体,通过遗传转化分别获得PPtGRF1/2d∷GUS启动子驱动GUS转基因杨树和mPtGRF1/2d过表达转基因杨树。通过GUS染色分析PtGRF1/2d杨树启动子的表达特性,并对过表达mPtGRF1/2d杨树不定根的发生时间、数目和长度进行统计,利用qRT-PCR分析不定根发育早期相关转录因子的表达。【结果】PtGRF1/2d主要在根的中柱鞘和根尖位置表达,说明其参与了根的形成;过量表达mPtGRF1/2d基因影响了杨树不定根的发生、发育,导致了不定根发生延迟、数目和长度均减少,且差异均达到显著水平或极显著水平,表明PtGRF1/2d对不定根的发生和发育具有负调控作用。qRT-PCR分析显示,过表达mPtGRF1/2d杨树的不定根发育相关基因PtSCR,Pt AIL9,Pt BBM2,Pt PLT1.2和Pt WOX11b的表达量均被下调,表明PtGRF1/2d的过量表达抑制了根原基发生和不定根发育相关的关键调控因子的表达,影响了根原基的发生和不定根的形成,导致不定根数目和长度的变化,最终影响了杨树的生长。【结论】PtGRF1/2d作为不定根形成的负调控因子,位于不定根调控途径的上游,通过下调促进不定根形成的相关转录因子的表达来抑制根原基形成和不定根发育,导致不定根发生延迟、数目和长度减少。

关键词： PtGRFl/2d 银腺杨84K 过量表达不定根负调控

干旱和高盐胁迫下钙离子依赖核酸酶基因CDD对银腺杨84K生长发育的影响

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林业科学 2019年第2期55卷 33-40页

作者：江成周厚君赵岩秋何辉楚立威宋学勤卢孟柱林木遗传育种国家重点实验室中国林业科学研究院林业研究所北京100091

【目的】钙离子依赖型脱氧核糖核酸酶(CDD)具有消化单链和双链DNA的活性,但CDD对水分等胁迫的响应尚未明确。本研究以CDD转基因银腺杨84K为材料,分析在干旱和高盐胁迫条件下CDD在84K杨生长中的作用,探讨CDD对干旱和高盐胁迫的响应,可为... 详细信息

【目的】钙离子依赖型脱氧核糖核酸酶(CDD)具有消化单链和双链DNA的活性,但CDD对水分等胁迫的响应尚未明确。本研究以CDD转基因银腺杨84K为材料,分析在干旱和高盐胁迫条件下CDD在84K杨生长中的作用,探讨CDD对干旱和高盐胁迫的响应,可为揭示杨树CDD基因在抗逆中的作用提供参考。【方法】以过表达PtoCDD和敲除PagCDD转基因银腺杨84K组培苗为材料,对其进行模拟干旱和高盐处理,分析其受干旱、高盐非生物胁迫条件下的表型变化,包括植株高、不定根数目。通过切片观察,分析不同处理条件下茎段木质部大小变化。利用qRT-PCR分析在不同处理条件下CDD转基因植株中水通道蛋白基因(PIP)的表达。【结果】与84K对照相比,在正常条件下CDD转基因植株株高没有显著差异,而干旱、高盐条件下CDD缺失突变体植株显著高于对照和CDD过表达植株,而过表达植株极显著低于对照及突变体。说明CDD过表达增强了杨树对干旱、高盐的敏感性,而敲除CDD后降低了杨树对干旱、高盐的敏感性。组织切片分析显示,在正常条件下木质部细胞层数呈现CDD过表达>对照84K>CDD缺失突变体,而在干旱、高盐条件下木质部细胞层数为CDD过表达对照84K>CDD过表达,且差异均达到显著水平或极显著水平,而干旱条件下差异不显著。表明CDD差异表达引起的不定根数目上的变化在一定程度上反映了杨树对干旱和高盐胁迫的敏感性。qRT-PCR分析显示,CDD过表达和CDD缺失突变体植株中均表现出多个PIP基因诱导高表达。表明CDD的表达变化可引起PIP基因不同成员的诱导表达,从而改变杨树的水分利用。【结论】杨树CDD的缺失或过量表达引起不定根数目的变化,同时改变了杨树的水分利用,影响对干旱和高盐胁迫的敏感性,导致胁迫下生长的变化。上述结果表明CDD参与杨树响应干旱和高盐胁迫过程。

关键词： CDD 银腺杨84K 干旱胁迫盐胁迫木质部不定根

杨树糖基转移酶GT14基因家族分析及响应盐胁迫基因的筛选

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分子植物育种 2021年

作者：张一凡宣灵灵卢孟柱赵岩秋曾为浙江农林大学林业与生物技术学院亚热带森林培育国家重点实验室

木材的形成基于维管形成层细胞的分裂分化，其中次生壁加厚是关键步骤。研究表明，植物在盐胁迫下细胞壁的组分与结构将发生变化，其中细胞壁表面多糖阿拉伯半乳聚糖AGP (arabinogalactan protein， AGP)起重要作用。AGP糖链是由糖基转... 详细信息

木材的形成基于维管形成层细胞的分裂分化，其中次生壁加厚是关键步骤。研究表明，植物在盐胁迫下细胞壁的组分与结构将发生变化，其中细胞壁表面多糖阿拉伯半乳聚糖AGP (arabinogalactan protein， AGP)起重要作用。AGP糖链是由糖基转移酶(glycosyltransferase， GT)催化合成，在细胞壁的生物合成中起关键作用，而且其表达量变化直接影响木质部的发育。本研究通过对杨树GT14 (Glycosyltransferase family14)家族进化关系与基因结构分析发现该家族基因在进化上具有较强的保守性。同时，3个杨树GT14基因在盐胁迫下表达量上调，且其中2个基因在体外表现出GlcAT活性。启动子元件分析发现这三个基因均包含多个非生物胁迫响应元件。本研究分析了杨树GT14基因功能，并为提高木本植物非生物耐逆作用提供线索。

关键词：杨树 GT14 进化分析盐胁迫