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鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 165-173页

作者：赵雪丽闫若潜王华俊王淑娟马震原谢彩华柴茂杨海波王翠刘影王东方河南省动物疫病预防控制中心、河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性... 详细信息

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

关键词：猪圆环病毒2型 rep基因猪圆环病毒3型 cap基因双重TaqMan MGB FQ-PCR

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重组猪α干扰素/白细胞介素-2的可溶性表达及体外活性研究

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农业生物技术学报 2024年第3期32卷 595-604页

作者：冯桂丹闫若潜马震原柴茂周建浩康台生王淑娟杨海波刘影谢彩华赵雪丽王翠河南农业大学动物医学院上海市动物疫病预防控制中心河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警与防控重点实验室河南科技大学动物科技学院

猪(Sus scrofa) α干扰素/白细胞介素-2 (porcine interferon α/porcine interleukin-2,PoIFN-α-linkerPoIL-2)在大肠杆菌(Escherichia coli)中多以包涵体形式表达，为在大肠杆菌系统中获得可溶性表达的具有活性的重组猪α干扰素/白介素2 (rPoIFN-α-linker-PoIL-2)蛋白，本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因进行可溶性改造并合成。将改造后的PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因克隆到表达载体p ET-32a(+)进行原核表达，采用镍铬亲和层析柱对表达的可溶性rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白进行纯化。分别采用淋巴细胞增殖检测法、ELISA方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白体外促猪外周血T淋巴细胞(peripheral blood T lymphocyte,PBLC)增殖活性，及其与抗猪白介素2单抗、抗猪α干扰素单抗发生特异性免疫反应的活性；采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在不同细胞系上抑制不同病毒的增殖活性。结果显示，PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因可在大肠杆菌中高效可溶性表达，表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白分子量大小约55 k D。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白经镍铬亲和层析柱纯化后纯度达90%以上。rPoIFN-α-linker-PoIL-2具有显著的促PBLC增殖活性(P<0.05)；可以与抗PoIL-2、PoIFN-α单抗发生特异性免疫反应。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在不同细胞上抑制不同病毒的增殖活性效价有差异，在猪肾细胞(porcine kidney cells,PK)-15、人羊膜细胞(human amniotic cells) WISH上抑制水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)增殖的活性单位分别为1.8×106和2.5×106IU/mg；在PK-15细胞上抑制伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)增殖的活性单位分别为2.2×104、1.3×105IU/mg；在非洲绿猴肾细胞(Verda Reno,Vero)上抑制猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)增殖的活性单位为3.2×104IU/mg。本研究获得了可溶性表达的rPoIFN-α-linkerPoIL-2蛋白，该蛋白在不同细胞上具有抑制VSV、PRV、SVA及PEDV等病毒增殖的活性，为进一步研究rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在猪体内的活性提供了基础资料。

关键词：猪α干扰素猪白细胞介素-2 嵌合基因可溶性表达体外活性

猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 413-418页

作者：周建浩王东方刘影王淑娟马震原谢彩华赵雪丽杨海波冯桂丹康台生胡煜锋李博文闫若潜河南农业大学动物医学院郑州450046 河南省动物疫病预防控制中心/河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008 河南科技大学动物科技学院洛阳471000 上海市动物疫病预防控制中心上海201103

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异... 详细信息

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

关键词：猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR 方法建立

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非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 118-130页

作者：刘影闫若潜王东方杨海波赵美雪宋丹赵雪丽谢彩华王淑娟马震原柴茂王翠刘梅芬河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应... 详细信息

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

关键词：非洲猪瘟病毒高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重FQ-PCR

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两种细胞在测定重组鸡α干扰素生物学活性中的比较

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河南畜牧兽医 2022年第18期43卷 11-12页

作者：王翠谢彩华钱勇河南省动物疫病预防控制中心河南郑州450008

鸡病毒性疾病对养鸡业危害严重,目前在兽医临床上尚无特效药物可以治疗。干扰素是一类动物机体产生的具有多重生物学功能的蛋白质,它能够激活机体内抗病毒效应从而起到抗病毒作用。尤其是α干扰素,其属于细胞水平上的广谱抗病毒、抗肿... 详细信息

鸡病毒性疾病对养鸡业危害严重,目前在兽医临床上尚无特效药物可以治疗。干扰素是一类动物机体产生的具有多重生物学功能的蛋白质,它能够激活机体内抗病毒效应从而起到抗病毒作用。尤其是α干扰素,其属于细胞水平上的广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫激活功能活性的细胞因子,其主要通过抑制病毒增殖、增强抗肿瘤活性以及加强NK细胞活性,增强其杀伤病毒感染细胞的能力,是一类具有临床应用价值的抗病毒制剂。

关键词：抗病毒制剂抗病毒作用病毒感染细胞广谱抗病毒危害严重 α干扰素生物学活性 NK细胞活性

河南牧原食品股份有限公司七分场动物疫病净化案例--全面构建猪场疫病净化体系

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农民文摘 2022年第10期 54-57页

作者：牛旻夏德利闫若潜谢彩华河南牧原食品股份有限公司七分场河南省动物疫病预防控制中心

牧原食品股份有限公司七分场位于河南省内乡县马山镇马坪村,占地面积140亩,设计年存栏能力2800头母猪,年可提供断奶仔猪5万头、出栏原种杜洛克5万头。自2005年6月份建设,2007年1月完成投产,场区选址建设时与周边防护距离符合动物防疫条... 详细信息

牧原食品股份有限公司七分场位于河南省内乡县马山镇马坪村,占地面积140亩,设计年存栏能力2800头母猪,年可提供断奶仔猪5万头、出栏原种杜洛克5万头。自2005年6月份建设,2007年1月完成投产,场区选址建设时与周边防护距离符合动物防疫条件,周围有良好的天然防护屏障。场区内部划分为隔离区、生活区、生产区,销售区,治污区。

关键词：动物防疫条件占地面积隔离区断奶仔猪防护屏障疫病净化防护距离销售区

甲醛溶液对重组鸡α干扰素工程菌灭活效果的影响

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河南畜牧兽医 2023年第9期44卷 3-4页

作者：王翠谢彩华刘影钱勇河南省动物疫病预防控制中心河南郑州450008

为了优化重组鸡α干扰素工程菌诱导表达后的灭活工艺,对甲醛溶液的使用浓度、灭活时间进行了比较,同时比较了灭活后重组鸡α干扰素蛋白制品的体外抗病毒活性。结果表明,0.4%的甲醛溶液37℃振荡灭活24h,灭活效果较好,同时蛋白制品体外抗... 详细信息

为了优化重组鸡α干扰素工程菌诱导表达后的灭活工艺,对甲醛溶液的使用浓度、灭活时间进行了比较,同时比较了灭活后重组鸡α干扰素蛋白制品的体外抗病毒活性。结果表明,0.4%的甲醛溶液37℃振荡灭活24h,灭活效果较好,同时蛋白制品体外抗病毒活性最高。

关键词：甲醛溶液工程菌灭活

ChIFN-α/ChIL-2嵌合基因的构建、融合表达及生物学活性研究

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ChIFN-α/ChIL-2嵌合基因的构建、融合表达及生物学活性研究

作者：谢彩华河南农业大学

学位级别：硕士

鸡的病毒性疾病种类多、危害大,当前,缺乏高效广谱的抗病毒药物可用;为了研究高效、广谱、无残留、无污染、不产生耐药性的基因工程抗病毒药物,解决当前兽医临床上无高效广谱抗病毒药物可用的技术问题,本研究进行了鸡α干扰素/白细胞介... 详细信息

鸡的病毒性疾病种类多、危害大,当前,缺乏高效广谱的抗病毒药物可用;为了研究高效、广谱、无残留、无污染、不产生耐药性的基因工程抗病毒药物,解决当前兽医临床上无高效广谱抗病毒药物可用的技术问题,本研究进行了鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因的构建、融合表达及生物学活性研究。首先设计含双酶切位点的引物采用RT-PCR方法自罗曼鸡脾脏总RNA扩增、克隆鸡白细胞介素-2(Chicken interleukin-2, ChIL-2)成熟肽基因;采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)技术将鸡α干扰素(chicken interferon alpha, ChIFN-α)和ChIL-2成熟肽基因序列通过一基因柔性linker (G4S)3连接,构建重组嵌合基因(ChIFN-α-linker-ChIL-2)并克隆入pGEM-T easy克隆载体,筛选ChIFN-α-linker-ChIL-2、ChIL-2阳性重组质粒并经限制性内切酶双切后连接入经相同酶切的pQE-30表达载体中以构建重组表达载体pQE-30/ChIFN-α-linker-ChIL-2、pQE-30/ChIL-2,将以上重组表达载体及以前已构建成功的pQE-30/ChIFN-α转化入E. coli. JM109中并采用IPTG诱导表达。分别对表达的重组ChIFN-α蛋白(rChIFN-α)、重组ChIL-2蛋白(rChIL-2)、重组融合ChIFN-α-linker- ChIL-2蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)采用尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等方法进行纯化。采用细胞病变抑制法分别检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白、单一rChIFN-α蛋白在鸡胚成纤维细胞(Chicken Embryo Fibroblasts,CEF)上抗水泡性口炎病毒(VSV)活性;采用MTT法和ChIL-2 ELISA试验方法分别检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中rChIL-2的含量、单一ChIL-2蛋白对ConA刺激的鸡T淋巴细胞增殖活性及与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫强毒株(NDV)和禽流感H9N2株( AIV H9N2 )抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的抗病毒活性及ChIL-2蛋白的疫苗免疫增强活性。结果表明:克隆了ChIL-2成熟肽基因,全长363bp,编码121个氨基酸;表达的rChIL-2蛋白分子量大小约为16.3 kD左右;经纯化后蛋白纯度在95%以上。采用SOE-PCR方法成功构建了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因及其pQE-30重组表达载体( pQE-30/ChIFN-α-linker-ChIL-2 ),对其测序结果表明重组表达质粒中插入的ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因全长909bp,编码300个氨基酸,插入方向正确,核苷酸序列无变异。表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9 kD,与预期大小相一致;蛋白经纯化后纯度在96%以上。活性研究结果表明:rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上具有明显的抗病毒活性,其在CEF细胞上的抗VSV活性单位(9.36×107IU/mg),明显高于单一rChIFN-α的抗病毒效价(4.09×105 IU/mg)。最低剂量为250pg的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可对Con A活化的鸡T淋巴细胞具有明显的增殖活性,随着剂量的增加,rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对鸡T淋巴细胞的增殖活性逐渐增强;rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应,计算rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2蛋白的相对含量约为8.12×10-7mg/mL,说明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中的ChIL-2蛋白具有免疫学生物活性。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显减轻NDV强毒株和AIV H9N2毒株所引起的胚体出血,并能显著延长鸡胚存活时间,表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡胚内具有明显的抗病毒活性。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV灭活疫苗具有显著的免疫增强作用,但对NDV活疫苗免疫增强作用不明显,表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内既具有抗病毒活性,同时也具有IL-2的免疫增强作用。以上结果表明rChIFN-α-lin

关键词：鸡α干扰素鸡白细胞介素2 重叠延伸PCR 嵌合基因融合表达生物学活性

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从幼儿的感知抓起———谈应用题的启蒙教学

江西教育（管理版）（A） 1999年第Z1期 82-83页

作者：谢彩华吉安县保育院

应应用题教学既是小学教学重点，又是难点，如果学生理解不了应用题中已知条件和所求问题之间的数量关系，则培养不了学生“解决实际问题的能力”。因此，应用题启蒙教学在整个小学阶段应用题的教学中起着奠基作用。那么，怎样在幼儿园... 详细信息

应应用题教学既是小学教学重点，又是难点，如果学生理解不了应用题中已知条件和所求问题之间的数量关系，则培养不了学生“解决实际问题的能力”。因此，应用题启蒙教学在整个小学阶段应用题的教学中起着奠基作用。那么，怎样在幼儿园加强应用题的启蒙教学呢？我认为：一...

关键词：简单应用题幼儿启蒙教学数学语言数量关系应用题教学计算教学分析解思想品德教育两个条件

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