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猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

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南方农业学报 2024年第4期55卷 1238-1248页

作者：刘思雨何颖卢冰霞赵武赵硕许心婷全琛宇秦毅斌欧阳康广西大学动物科学技术学院/广西高校动物疫病预防与控制重点实验室/广西兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDC... 详细信息

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。

关键词：猪丁型冠状病毒 NSP14蛋白原核表达多克隆抗体制备间接ELISA

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猪繁殖与呼吸综合征病毒快速鉴别检测及免疫防控技术研究

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猪繁殖与呼吸综合征病毒快速鉴别检测及免疫防控技术研究

作者：许心婷广西大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)所致的一种高度接触性传染病,以母猪繁殖障碍以及各种年龄猪特别是仔猪呼吸道疾病为特征,给养猪业造成巨大的经济损失。临床上,PRRSV流行... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)所致的一种高度接触性传染病,以母猪繁殖障碍以及各种年龄猪特别是仔猪呼吸道疾病为特征,给养猪业造成巨大的经济损失。临床上,PRRSV流行毒株日益多样化和复杂化,给PRRS的有效防控带来很大困难。建立快速、特异的鉴别检测方法,掌握当前广西PRRSV流行毒株的特点,探索有针对性的免疫防控措施,对有效防控PRRS具有重要意义。1.同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR方法的建立及应用为建立PRRSV的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪的其它病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×103拷贝/μL。应用所建立的方法,对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份,TJM-F92疫苗株7份,并且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明,本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。2.广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2和ORF5基因的遗传多样性分析为了解广西地区PRRSV流行毒株的遗传进化情况,对2014-2016年间来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2和ORF5基因的扩增和测序分析。结果,获得34个Nsp2基因序列和45个ORF5基因序列,均属于美洲型毒株。Nsp2基因间核苷酸序列的同源性为91.8%～100%,与 PRRSV 美洲型毒株 VR-2332、CH-1a、JXA1 及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为81.3%～84.3%、88.9%～92.1%、94.3%～99.3%、73.5%～75.1%,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为51.5%～53.2%。ORF5基因间核苷酸序列的同源性为82.8%～100%,与 PRRSV 美洲型毒株 VR-2332、CH-1a、JXA1 及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为83.7%～99.5%、85%～95%、83.8%～99.7%、83.2%～86.4%,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为62.4%～64.5%。基于Nsp2和ORF5基因推导的氨基酸序列绘制的遗传进化树中,广西地区的毒株主要分布在以JXA1为代表的IV亚群。表明,当前广西PRRSV流行毒株以JXA1株为代表的高致病性美洲型毒株为主,各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差异,尚未发现欧洲型毒株和NADC30类美洲型毒株。3.PRRSV野毒感染猪群免疫接种弱毒活疫苗的效果分析为评估PRRS弱毒活疫苗的免疫效果,本研究在两个小型猪场各选取2窝仔猪,在免疫接种PRRSV弱毒活疫苗后不同时间采集血清,应用RT-PCR检测PRRSV核酸,应用N-ELISA和G-ELISA两种试剂盒检测PRRSV抗体。结果,免疫前Od可以从仔猪血清中检测到PRRSV野毒株核酸,直到免疫后30d;相对应的母猪在免疫前0 d可从血清检测到PRRSV野毒株核酸。试验仔猪在免疫前0 d未能检测到PRRSV抗体,但在免疫后30 d直到150 d试验结束均可检测到PRRSV抗体,其中N-ELISA试剂盒的阳性检出率在免疫后30、60 d高于G-ELISA试剂盒的阳性检出率,而在免疫后120、150 d则低于G-ELISA试剂盒的阳性检出率。使用两种ELISA试剂盒共同时检测216份血清样品,检测结果的符合率为95.83%;配对X2检验,P>0.05,两者差异不显著;kappa值为0.87,属于极强一致性;两者相关系数r为0.605,具有显著线性相关。表明,免疫接种弱毒活疫苗可以有效清除野毒感染猪群中的野毒株,N-ELISA和G-ELISA两种ELISA试剂盒均可用于评估弱毒活疫苗的免疫效果。4.高水平母源抗体仔猪免疫接种PRRSV弱毒活疫苗的效果分析本研究于大型规模养殖场进行两次试验,每次选取3窝仔猪,在免疫接种PRRSV弱毒活疫苗后不同时间采集血清,应用RT-PCR检测PRRSV核酸,应用N-ELISA和G-ELISA两种试剂盒检测PRRSV抗体。结果,在免疫接种后60 d内可在试验猪血清中检测到疫苗株核酸,而在整个试验期间始终未能检测到野毒株核酸。试验猪在免疫后Od具有较高的母源抗体,阳性率达到100%,此后逐渐下降,第28/60 d(第2次试验/第1次试验)达到低点后稳步提高,从第60/90d到15

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒多重RT-PCR 遗传多样性弱毒活疫苗检测方法分子流行病学免疫措施

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一例水律蛇博特氏菌性肺炎诊治

黑龙江畜牧兽医（下半月） 2016年第4期 187-189页

作者：魏志鹏赵明龙许心婷陈汉忠王凯吴文德广西大学动物科学技术学院南宁530003

水律蛇（Ptyas mucosus）又称滑鼠蛇,隶属于游蛇科鼠蛇属,无毒。在民间水律蛇有很多别称,如水南蛇、华锦蛇、乌肉蛇、长标蛇、草锦蛇等。国内主要分布于云、贵、川、湘、鄂、两广等南方各地[1]。与其他无毒蛇类相比,水律蛇不仅肉质鲜美... 详细信息

水律蛇（Ptyas mucosus）又称滑鼠蛇,隶属于游蛇科鼠蛇属,无毒。在民间水律蛇有很多别称,如水南蛇、华锦蛇、乌肉蛇、长标蛇、草锦蛇等。国内主要分布于云、贵、川、湘、鄂、两广等南方各地[1]。与其他无毒蛇类相比,水律蛇不仅肉质鲜美,并且胆、蜕等是很多顽固性疾病（如风湿、中风等）的首选天然药材,是典型的食药两用蛇类,有很高的经济价值。无论是民间土方,

关键词：水律蛇博特滑鼠蛇天然药材顽固性疾病游蛇科抑菌圈直径琼脂培养基药敏试验如水

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒感染情况调查及其欧洲型毒株ORF5基因变异分析

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中国动物传染病学报 2023年第5期31卷 135-144页

作者：赵硕段群棚何颖卢冰霞许心婷秦毅斌李斌全琛宇梁家幸周英宁蒋冬福陈婷婷卢敬专陈忠伟赵武广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室南宁530001

为了解广西近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染情况及其欧洲型PRRSVORF5的遗传变异特点,2020年6月至2021年5月,采集广西14个设区市疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪病料、血清共782份,进行PRRSV的qRT-PCR分型检测及ORF5基因扩增... 详细信息

为了解广西近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染情况及其欧洲型PRRSVORF5的遗传变异特点,2020年6月至2021年5月,采集广西14个设区市疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪病料、血清共782份,进行PRRSV的qRT-PCR分型检测及ORF5基因扩增,并运用SPSS23.0、DNAStar、MEGA X等生物学软件对检测结果及获得的PRRSVORF5基因序列进行分析。结果显示:样品检测总阳性率为29.54%,其中欧洲型(PRRSV-1)PRRSV阳性率为6.78%,美洲型(PRRSV-2)PRRSV阳性率为22.76%,表明受检猪群普遍存在PRRSV感染;在不同设区市中,贵港、崇左感染率最高(50.00%);在不同季度中,冬季感染率最高(41.00%);在不同年龄阶段猪群中,保育猪感染率最高(53.42%);感染主要以PRRSV-2为主,新发PRRSV-1感染;广西新发PRRSV-1在ORF5基因上存在相同独特的核苷酸及氨基酸变异特点,与中国香港分离欧洲株HKEU16亲缘关系较近,可能是在引种等贸易过程中所引进,并在饲养环境、免疫压力等多种因素的作用下发生了一定的变异;广西近期受检猪群普遍存在PRRSV-2感染,新出现PRRSV-1的感染,猪场应重视并及时调整、实施针对性的PRRS防控计划。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒感染情况欧洲型 ORF5基因遗传变异分析

高水平母源抗体仔猪接种猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗的免疫效果分析

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中国预防兽医学报 2017年第5期39卷 402-406页

作者：施开创许心婷舒秀远莫胜兰陈汉忠广西动物疫病预防控制中心广西南宁530001 广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 广西黔江示范牧场广西来宾546133

为评估猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒活疫苗的免疫效果,本研究于规模猪场选取具有母源抗体的仔猪,接种PRRS弱毒活疫苗后不同时间采集血清,应用RT-PCR检测PRRS病毒(PRRSV)核酸,应用N-ELISA和G-ELISA两种试剂盒检测PRRSV抗体。结果显示,... 详细信息

为评估猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒活疫苗的免疫效果,本研究于规模猪场选取具有母源抗体的仔猪,接种PRRS弱毒活疫苗后不同时间采集血清,应用RT-PCR检测PRRS病毒(PRRSV)核酸,应用N-ELISA和G-ELISA两种试剂盒检测PRRSV抗体。结果显示,在免疫接种后60 d内可在实验仔猪血清中检测到疫苗株核酸,而在整个实验期间未能检测到野毒株核酸。仔猪在免疫前具有较高的母源抗体,阳性率达到100%,此后逐渐下降,在免疫后第28 d/60 d(第2次试验/第1次试验)降到低点后又稳步升高,从免疫后第60 d/90 d到150 d试验结束时阳性率均达到100%。应用两种ELISA试剂盒同时检测329份血清样品,检测结果的符合率为96.96%;配对χ~2检验,p>0.05,两者差异不显著;Kappa值为0.81,属于极强一致性;两者相关系数r为0.794,具有显著线性相关。本研究结果表明,高水平母源抗体猪群接种弱毒活疫苗后取得良好的免疫效果,可选用N-ELISA或G-ELISA试剂盒进行免疫效果评估。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗间接ELISA RT-PCR 抗体病毒核酸

PRRSV美洲型经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

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中国畜牧兽医 2017年第3期44卷 879-887页

作者：施开创许心婷胡杰粟艳琼陆文俊陈汉忠广西动物疫病预防控制中心南宁530001 广西大学动物科学技术学院南宁530005

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条... 详细信息

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×103拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型多重RT-PCR 野毒株疫苗株

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习惯性便秘母猪与正常母猪血钙浓度比较试验

黑龙江畜牧兽医（下半月） 2015年第4期 60-61页

作者：尹彦文邹联斌胡杰莫胜兰韦显凯屈素洁许心婷李凤梅广西动物疫病预防控制中心南宁530001 广西大学动物科学技术学院南宁530005

母猪便秘多发于农村散养户,主要由于长期饲喂米糠等粗饲料及饮水不足等因素引起,因便秘初期容易被忽视且治疗不当易形成习惯性便秘[1]。兽医工作者对母猪习惯性便秘做了很多研究,对该病的原因和防治等都做了大量报道[2-4],但大多根据临... 详细信息

母猪便秘多发于农村散养户,主要由于长期饲喂米糠等粗饲料及饮水不足等因素引起,因便秘初期容易被忽视且治疗不当易形成习惯性便秘[1]。兽医工作者对母猪习惯性便秘做了很多研究,对该病的原因和防治等都做了大量报道[2-4],但大多根据临床经验形成,缺乏试验数据支持。本试验通过测定八步区4个乡镇的散养户中空怀的40头便秘母猪和40头正常母猪的血清钙值,来探讨母猪血钙浓度与其便秘的关系,从而为治疗母猪便秘提供一定的依据。

关键词：习惯性便秘农村散养户血钙浓度兽医工作者试验数据饲养管理情况血清钙八步区营养需要饲喂方法

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大片形吸虫幼虫的培育及其感染小鼠的研究

中国畜牧兽医 2014年第12期41卷 244-250页

作者：李雪黄甜朱丙伦吴文德魏志鹏赵明龙许心婷陈汉忠广西大学动物科技学院广西南宁530005

本试验旨在培育大片形吸虫囊蚴,着重研究大片形吸虫在中间宿主体内的发育过程和临床病理变化。人工培养和孵化大片形吸虫虫卵,用孵化出来的大片形吸虫毛蚴感染中间宿主小土蜗螺,收集大片形吸虫囊蚴,再用囊蚴感染试验小鼠。结果显示,囊... 详细信息

本试验旨在培育大片形吸虫囊蚴,着重研究大片形吸虫在中间宿主体内的发育过程和临床病理变化。人工培养和孵化大片形吸虫虫卵,用孵化出来的大片形吸虫毛蚴感染中间宿主小土蜗螺,收集大片形吸虫囊蚴,再用囊蚴感染试验小鼠。结果显示,囊蚴经口感染试验小鼠后1周即可在肝脏找到虫体,幼虫可在小鼠体内发育生存7~8周,随着时间的推移和感染囊蚴数量不同,可给小鼠肝脏造成不同程度的病变,甚至造成死亡。剖检小鼠可见肝脏质地脆,颜色发黄,脾脏肿大等严重病理变化。因此,可利用小鼠作为大片形吸虫幼虫感染的试验动物,进行片形吸虫病的早期诊断、免疫预防和治疗等方面的研究。

关键词：大片形吸虫小土蜗螺毛蚴囊蚴小鼠

2015—2021年广西部分猪场5种疫病的血清学检测

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中国动物检疫 2022年第2期39卷 26-32页

作者：许心婷段群棚何颖何文娜郭旋赵硕蒋家霞陈婷婷陈忠伟张宁广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530001 广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 广西农垦永新畜牧集团金光有限公司广西南宁530022 广西农垦永新畜牧集团新兴有限公司广西柳州545000 广西桂垦牧业有限公司广西南宁530001

为了解广西猪群中猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫、猪圆环病毒病和伪狂犬病5种疫病的免疫水平及伪狂犬病病毒(PRV)感染状况,对2015—2021年广西地区1 012个猪场送检的24 263份血清样品进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PR... 详细信息

为了解广西猪群中猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫、猪圆环病毒病和伪狂犬病5种疫病的免疫水平及伪狂犬病病毒(PRV)感染状况,对2015—2021年广西地区1 012个猪场送检的24 263份血清样品进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)以及PRV-gB、PRV-gE抗体检测,并对这5种病毒的抗体阳性率按照不同年份、不同季节、不同地市和不同生长阶段进行统计分析。结果显示:2015—2021年送检猪场的CSFV、PRRSV、FMDV、PCV2、PRV-gB和PRV-gE抗体的场总阳性率分别为99.19%、96.09%、99.48%、99.71%、100%和49.87%,个体总阳性率分别为81.22%、76.51%、84.53%、89.43%、94.67%和20.58%。不同季节和不同生长阶段的抗体阳性率存在一定差异,其中CSFV、PRRSV、FMDV抗体春季的个体阳性率高于其他季节,PCV2和PRV-gB抗体个体阳性率夏秋季最高,保育猪的CSFV、PRRSV和FMDV抗体个体阳性率未达到70%。结果表明,广西猪群上述5种疫病的免疫效果总体较为理想,但PRRSV免疫合格率有待提高,猪群中仍存在一定的PRV野毒感染,且不同生长阶段、不同季节的免疫水平有一定差异。因此,应制定科学的免疫程序,持续加强免疫和监测,及时淘汰PRV野毒感染猪,降低上述5种疫病的发生风险。

关键词：猪病毒性疫病血清学检测猪场免疫水平野毒感染广西