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宿主蛋白Rab11a对牛病毒性腹泻病毒复制的影响

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中国动物传染病学报 2022年

作者：权冉葛丽娟陈俊贞袁圆圆付强史慧君新疆农业大学动物医学学院

为了探索宿主蛋白Rab11a在感染牛病毒性腹泻病毒（BVDV）后，对细胞增殖的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Rab11a基因稳定敲除的MDBK细胞株，设计靶向Rab11a基因的向导RNA表达载体，采用Western blot检测Rab11a基因敲除后的蛋白...

为了探索宿主蛋白Rab11a在感染牛病毒性腹泻病毒（BVDV）后，对细胞增殖的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Rab11a基因稳定敲除的MDBK细胞株，设计靶向Rab11a基因的向导RNA表达载体，采用Western blot检测Rab11a基因敲除后的蛋白表达情况；使用实时荧光定量qPCR、免疫荧光染色试验、Reed-Muench法等技术检测BVDV感染Rab11a KO细胞后病毒RNA水平、双链RNA（dsRNA）积累水平、病毒滴度及致细胞病变（CPE）情况等。Western blot检测结果显示，成功构建出Rab11a基因敲除的细胞Rab11a KO；Rab11a基因敲除显著抑制BVDV 5’UTR mRNA和dsRNA水平的积累，感染36 h后，Scramble细胞明显有大量细胞病变，出现皱缩、碎裂、形成空泡后脱落等现象，Rab11a KO细胞的CPE现象明显低于Scramble细胞；在BVDV感染细胞12 h后，与Scramble细胞相比，Rab11a KO细胞的病毒滴度显著性降低。综上作述，结果证明了敲除MDBK细胞的Rab11a基因对BVDV在胞内复制起到抑制作用。本研究结果了解了宿主蛋白Rab11a与BVDV的相互作用，以及Rab11a对病毒的复制增值的作用提供了新的科学依据。

关键词：

E型牛肠道病毒新疆BL311株的分离鉴定及致病性分析

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中国动物传染病学报 2022年

作者：陈俊贞李祯张成远袁圆圆张乐乐付强史慧君新疆农业大学动物医学学院中宁县动物疾病预防控制中心

以采集自新疆博乐某牛场腹泻牛的粪便，接种胎牛肾细胞（MDBK），盲传15代分离牛肠道病毒（BEV），使用蚀斑纯化法连续纯化5轮得到纯化病毒，并命名为BL311。使用BL311株感染MDBK细胞后，观察细胞病变效应（CPE），采用Reed-Muench法计...

以采集自新疆博乐某牛场腹泻牛的粪便，接种胎牛肾细胞（MDBK），盲传15代分离牛肠道病毒（BEV），使用蚀斑纯化法连续纯化5轮得到纯化病毒，并命名为BL311。使用BL311株感染MDBK细胞后，观察细胞病变效应（CPE），采用Reed-Muench法计算病毒滴度，利用理化性质检测、透射电镜观察、基因型分析及对小鼠的致病性试验鉴定BL311分离株。结果显示，BL311分离株感染MDBK细胞24 h后细胞出现变圆、破裂和脱落等致细胞病变效应，病毒滴度显著增高（P<0.05）；36 h后细胞出现大量CPE，病毒滴度极显著增高（P<0.01）。理化性质鉴定结果显示BL311分离株对有机溶剂具有一定抵抗力，紫外光照射1 h或56℃环境培养1 h可使毒株失活。电镜下观察BL311毒株为直径25～30 nm的球形颗粒，具有典型的小RNA病毒粒子形态。基因测序结果显示BL311毒株的基因全长是7514 nt，与国内报道的HY12分离株（KF748290）的同源性高达99%，属于BEV-E3型。致病性实验结果显示，BALB/c小鼠感染BL311毒株后，器官表现为肿大，且伴有出血；病理组织学观察可见组织器官炎性细胞浸润及出血。本研究分离纯化得到一株具有较强致病性的E种肠道病毒，将为新疆BEV的流行病学调查及致病机制研究提供依据。

关键词：

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囊泡相关膜蛋白A调控牛病毒性腹泻病毒复制

微生物学通报 2022年第2期49卷 635-644页

作者：史慧君袁圆圆郭妍婷陈俊贞杨莉冉多良付强新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A(vesicle-associated membrane protein A,VAPA)... 详细信息

[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A(vesicle-associated membrane protein A,VAPA)对BVDV复制的影响。[方法]根据GenBank中VAPA基因,使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA(small guide RNA,sgRNA),融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素连续筛选5代,使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout,KO)情况;BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后,收集细胞提取总RNA,并将等质量的RNA反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)分别检测BVDV 5’-非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA水平和双链RNA(double strand RNA,dsRNA)积累水平,于BVDV感染后不同时间观察致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,并收集子代病毒液,使用Reed-Muench法计算子代病毒滴度变化。接种等量VAPAKO和乱码序列对照scramble细胞后不同时间进行活细胞计数,检测VAPA KO是否影响细胞活性。[结果]慢病毒感染后使用嘌呤霉素筛选,Western Blot检测VAPA蛋白明显降低,成功获得VAPAKO细胞;与对照scramble细胞相比,BVDV感染VAPAKO细胞后5’-UTR mRNA水平和dsRNA积累量均显著性降低,BVDV感染造成的CPE明显推迟并减轻,子代病毒滴度在12 h和36 h显著下降,在48 h极显著下降;与scramble细胞相比,VAPA KO细胞活性未受影响。[结论]VAPAKO后显著性抑制BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供重要靶标。

关键词：囊泡相关膜蛋白A 牛病毒性腹泻病毒复制水平双链RNA 病毒滴度

心血管内科住院病人血尿酸水平、尿酸盐晶体与冠脉钙化积分、动脉硬化指标的相关性研究

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心血管内科住院病人血尿酸水平、尿酸盐晶体与冠脉钙化积分、动脉...

作者：袁圆圆福建医科大学

学位级别：硕士

目的探讨动脉硬化指标、冠脉钙化积分与住院病人血尿酸水平、尿酸盐晶体沉积的相关性。方法收集2016年7月-2017年2月心内科住院患者104例,所有患者均常规检测血尿酸水平并且行关节彩色超声检查,检测双侧第一跖趾关节、踝关节、膝关节有... 详细信息

目的探讨动脉硬化指标、冠脉钙化积分与住院病人血尿酸水平、尿酸盐晶体沉积的相关性。方法收集2016年7月-2017年2月心内科住院患者104例,所有患者均常规检测血尿酸水平并且行关节彩色超声检查,检测双侧第一跖趾关节、踝关节、膝关节有无尿酸盐晶体沉积。其中36例可疑冠心病患者行冠状动脉CTA检查,并计算冠脉钙化积分,100例患者行血管功能检查,测量肱踝脉搏波传导速度(ba-PWV)、踝-臂指数(ABI)和脉压(PP)。分别分析肱踝脉搏波传导速度(ba-PWV)、踝-臂指数(ABI)脉压(PP)及冠脉钙化积分与血尿酸水平、关节尿酸盐晶体沉积有无相关性。结果(1)随着血尿酸水平升高,关节尿酸盐晶体沉积率增加。(2)血尿酸水平正常组与血尿酸升高组之间肱踝脉搏波传导速度、踝臂指数、脉压、冠脉钙化率[ba PWV(1544.00 vs 1611.25cm/s)、(ABI)(1.14 vs 1.17)、(PP)(53.5 vs54.0mm Hg)、(52.4%vs 73.3%),P值均>0.05]无显著统计学差异。(3)无关节晶体沉积组和关节晶体沉积组之间肱踝脉搏波传导速度、踝臂指数、脉压及冠脉钙化率[ba PWV(1698.81 vs 1588.72cm/s)、ABI(1.15 vs 1.18)、PP(60.46 vs 55.68mm Hg)(45.5%vs 68.0%),P值均>0.05]无显著统计学差异。(4)肱踝脉搏波传导速度(ba PWV)、脉压(PP)、冠脉钙化积分与关节尿酸盐晶体的Spearman相关系数分别为-0.167、-0.167、0.096,P值均>0.05。(5)肱踝脉搏波传导速度(ba PWV)危险因素的多元线性回归结果提示年龄、收缩期血压、糖尿病是其主要危险因素。脉压(PP)的主要危险因素为SBP、年龄、性别。冠脉钙化Logistic回归分析提示年龄是其主要危险因素。结论本研究未证实动脉硬化指标、冠脉钙化积分与血尿酸水平、尿酸盐晶体沉积相关,仍需大量大样本的研究进一步证实其有无关联性。

关键词：动脉硬化冠脉钙化尿酸盐晶体血管功能超声冠脉CTA

囊泡运输蛋白SEC22B敲低对牛病毒性腹泻病毒复制的影响研究

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农业生物技术学报 2023年第4期31卷 784-790页

作者：张成远袁圆圆郭妍婷杨莉冉多良付强史慧君新疆农业大学动物医学学院

牛病毒性腹泻病的感染情况日趋严重，给养殖业造成了严重的损失，目前我国缺乏有效的治疗手段，导致感染模式复杂化，其致病机制和病毒-宿主之间相互作用研究也尚不清楚。为了探究囊泡运输蛋白(vesicle transport protein homolog, SEC2... 详细信息

牛病毒性腹泻病的感染情况日趋严重，给养殖业造成了严重的损失，目前我国缺乏有效的治疗手段，导致感染模式复杂化，其致病机制和病毒-宿主之间相互作用研究也尚不清楚。为了探究囊泡运输蛋白(vesicle transport protein homolog, SEC22B)敲低对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的影响，根据GenBank数据库中SEC22B基因序列，使用Benchling平台设计向导RNA(small guide RNA, sgRNA)，克隆至LentiCRISPR v2载体后进行慢病毒包装，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲低胎牛肾细胞(madin-darby bovine kidney cells, MDBK)中的SEC22B基因表达，使用Western blot鉴定SEC22B基因敲低(knockdown, KD)情况；BVDV感染SEC22B KD细胞不同时间后，分别使用qPCR和免疫荧光染色检测BVDV 5’UTR mRNA水平变化和双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)量，使用Reed-Muench法测定BVDV感染不同时间后子代病毒滴度变化。Western blot检测发现，与对照Scramble细胞相比，SEC22B KD细胞中SEC22B蛋白表达量显著降低；与BVDV感染Scramble细胞相比，BVDV感染SEC22B KD细胞后5’UTR mRNA水平和dsRNA量均极显著降低(P<0.01)，同时，子代病毒滴度极显著下降(P<0.01)。结果表明，敲低SEC22B基因后显著抑制BVDV复制，本研究为BVDV防控新方法的建立提供理论依据。

关键词：囊泡运输蛋白(SEC22B) 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) CRISPR/Cas9基因编辑技术基因敲低复制

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焊接生产管理系统研究与开发

焊接生产管理系统研究与开发

作者：袁圆圆南昌航空大学

学位级别：硕士

本文针对焊接生产企业的生产特点建立焊接生产管理系统,其主要作用是对焊接生产信息的集成进行综合处理和有效利用,从而规范焊接生产管理,提高工作效率,降低管理成本,进而提高焊接生产企业的市场竞争能力、促进企业向新型信息化焊接生... 详细信息

本文针对焊接生产企业的生产特点建立焊接生产管理系统,其主要作用是对焊接生产信息的集成进行综合处理和有效利用,从而规范焊接生产管理,提高工作效率,降低管理成本,进而提高焊接生产企业的市场竞争能力、促进企业向新型信息化焊接生产企业发展。本文研究成果包括以下几点:(1)根据实地调查研究,构建了设计部门管理、生产部门管理、质检部门管理、设备管理和仓库管理等模块框架并分析数据库系统结构。明确系统需要完成的功能,满足了焊接生产从设计到焊接,从订单到出库等业务管理。(2)采用C/S结构模式,将系统应用程序分为两部分,服务器端和客户端:服务器端是信息、功能的集成可满足多个用户共享;而客户端的作用是提供用户的操作界面。(3)建立数据库系统,创建了焊接生产涉及的数据库表,完善本系统的数据库。方便企业对生产资料的查询、添加管理。(4)在系统设计阶段,完成了对象类的包图、静态类图和时序图。在系统实现阶段,运用Visual C++6.0开发工具实现系统各模块的功能,其中包括生产计划管理功能、任务指令管理功能、焊接生产指导书管理功能、派工信息管理功能、生产领料管理功能、质量检测管理功能、员工信息管理功能、焊接设备管理功能和焊接成品、母材、焊材的管理功能等等。符合企业生产活动的实情,满足了焊接企业生产管理需求。继而提高了焊接生产管理效率,降低了生产成本。(5)设置用户管理权限,满足企业定向管理,同时提高了系统安全性、保密性。(6)实现将复杂报表保存到Excel。方便用户可随时将报表打印为纸质版。通过对焊接生产管理系统需求的分析与总结,设计开发了一套基于Oracle的焊接生产管理系统。本系统将焊接生产流程的设计与管理集为一体,实现了焊接生产数据及文件的存储与管理等功能。提高了焊接生产的管理水平与各类表单编制效率,同时也使得焊接相关经验知识能被有效地传承下来。

关键词：焊接管理系统 Oracle report控件 Excel

细胞信号肽酶复合体亚基1与牛病毒性腹泻病毒复制的相关性分析

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畜牧兽医学报 2022年第6期53卷 1870-1876页

作者：史慧君董文丽郭妍婷袁圆圆陈俊贞杨莉冉多良付强新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

旨在探明信号肽酶复合体亚基1(signal peptidase complex subunit 1,SPCS1)影响牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的作用。使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向SPCS1基因的sgRNA,克隆至慢病毒载体lentiCRISPR v2,连同包装质粒pSPAX2和pMD2.G转染至人胚肾细胞HEK-293T中,包装慢病毒并感染MDBK细胞,用嘌呤霉素筛选5代后获得敲低SPCS1蛋白后稳定表达的细胞,用Western blot检测SPCS1蛋白表达的情况;使用荧光定量PCR和免疫荧光分析检测BVDV感染SPCS1蛋白敲低细胞不同时间后5′非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA的水平和双链RNA(double-stranded,dsRNA)积累,利用倒置显微镜观察BVDV致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,根据Reed-Muench方法测定病毒滴度变化情况。结果:Western blot检测SPCS1蛋白表达量明显下降,成功构建SPCS1敲低(knockdown,KD)细胞;BVDV感染SPCS1 KD细胞后与对照Scramble相比,BVDV 5′UTR mRNA水平和dsRNA量均显著性降低(P<0.01),CPE现象推迟并减弱,子代病毒滴度显著性下降(P<0.01),最高降低95.8%。SPCS1敲低后显著性影响BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供理论依据。

关键词：信号肽酶复合体亚基1 牛病毒性腹泻病毒 5′非翻译区双链RNA 复制

热休克蛋白HSP90B1影响牛病毒性腹泻病毒复制的研究

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畜牧兽医学报 2023年第2期54卷 683-693页

作者：陈俊贞权冉付强葛丽娟袁圆圆张成远李建林史慧君新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

旨在探究热休克蛋白90β家族成员1(heat shock protein 90 beta family member 1,HSP90B1)对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的影响。本研究通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测BVDV感染MDBK细胞后HSP90B1 mRNA和蛋白的表达情况,利用CRISPR/Cas9技术构建HSP90B1 KO细胞,计数检测敲除HSP90B1对细胞生长的影响,BVDV TC株感染HSP90B1 KO和对照组Scramble细胞后,使用qRT-PCR、免疫荧光、病毒滴度以及细胞病变效应(cytopathic effects,CPE)检测BVDV的复制情况。结果表明,qRT-PCR检测显示BVDV感染24 h时与空白组相比HSP90B1 mRNA转录水平显著升高(P<0.05),36 h后极显著升高(P<0.01),同时Western blot显示BVDV感染组HSP90B1蛋白的表达水平较未感染组明显增加;Western blot检测显示,与MDBK细胞相比HSP90B1 KO细胞中的HSP90B1蛋白表达量明显降低;细胞计数显示,相同生长时间的Scramble、HSP90B1 KO细胞与MDBK细胞的数量未见差异;qRT-PCR结果显示,与对照组相比,HSP90B1 KO细胞中BVDV 5′UTR RNA水平在BVDV感染12 h后显著降低(P<0.05),36 h后极显著降低(P<0.01);免疫荧光检测结果显示,与对照组相比,HSP90B1 KO细胞中的绿色荧光明显减少;BVDV感染后病毒滴度与对照组相比,12 h后HSP90B1 KO的病毒滴度显著降低(P<0.05),36 h后极显著降低(P<0.01),CPE显示,在感染12 h后对照组细胞出现明显CPE,而HSP90B1 KO细胞仅显示出少量CPE,感染36 h后HSP90B1 KO细胞出现明显CPE,此时对照组细胞出现大量CPE并有细胞脱落。以上结果表明BVDV诱导MDBK细胞中HSP90B1的表达;利用CRISPR/Cas9技术成功敲除MDBK细胞的HSP90B1基因,构建HSP90B1 KO细胞,试验表明敲除HSP90B1能够抑制BVDV的复制。

关键词：热休克蛋白牛病毒性腹泻病毒 CRISPR/Cas9 复制

稳定表达Cas9蛋白的BHK-21单克隆细胞系的建立与鉴定

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中国兽医杂志 2022年第9期58卷 12-17页

作者：葛丽娟权冉陈俊贞袁圆圆付强李泽宇史慧君新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选... 详细信息

为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选,筛选5代后通过有限稀释法培养Cas9单克隆细胞,利用Western blot检测Cas9蛋白的表达。为获得Cas9活性强的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,根据紧密连接蛋白(OCLN)基因序列,设计针对OCLN基因的sgRNAs,构建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组质粒,测序鉴定后将lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组载体转染BHK-21-Cas9单克隆细胞系。使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,经过Western blot检测OCLN蛋白的表达。Western blot检测Cas9蛋白结果显示,共获得了17株BHK-21-Cas9单克隆细胞系;测序结果显示,lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA载体构建成功,通过Western blot鉴定,有2株Cas9编辑效果好、具有高敲除效率的BHK-21单克隆细胞系。结果表明,本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,可以用于CRISPR/Cas9敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选影响病毒感染和复制的功能基因提供了科学依据。

关键词： Cas9蛋白 BHK-21细胞系慢病毒紧密连接蛋白