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猫冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备

中国动物传染病学报 2024年

作者：王俊娜张淼邓小莺虞凌雪李国新刘光清中国农业科学院上海兽医研究所河南科技学院

为了制备猫冠状病毒（FCoV）N蛋白单克隆抗体，构建了重组质粒pClod-sumo-N。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示，在16℃、0.1 mmol/L IPTG、诱导24 h条件下，获得了大小约70 kDa的可溶性... 详细信息

为了制备猫冠状病毒（FCoV）N蛋白单克隆抗体，构建了重组质粒pClod-sumo-N。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示，在16℃、0.1 mmol/L IPTG、诱导24 h条件下，获得了大小约70 kDa的可溶性重组N蛋白。Wester blot分析证实，该重组蛋白能与标签HIS抗体发生反应。重组蛋白用镍离子金属亲和层析柱纯化后，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，通过细胞融合、筛选和亚克隆，获得了1株能稳定分泌N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株（3E6B7）。Western blot与IFA结果显示该单克隆抗体能与猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）发生特异性反应。本研究获得的单克隆抗体为FCoV N蛋白的结构和功能研究以及诊断方法的建立提供了良好的工具。

关键词：猫传染性腹膜炎病毒 N蛋白单克隆抗体原核表达

猪繁殖与呼吸综合征重组病毒非必需基因区的鉴定

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中国预防兽医学报 2015年第4期37卷 246-249页

作者：曲泽慧高飞李丽薇姜一峰虞凌雪周艳君郑海红童光志中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的非必需基因区,本研究在高致病性PRRSV细胞致弱株感染性克隆Hu N4-F112的基础上,在其基因组ORF1b和ORF2a之间插入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,并在外源基因3'端下游插入该病毒的转录调控序列... 详细信息

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的非必需基因区,本研究在高致病性PRRSV细胞致弱株感染性克隆Hu N4-F112的基础上,在其基因组ORF1b和ORF2a之间插入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,并在外源基因3'端下游插入该病毒的转录调控序列6(TRS6),构建PRRSV-EGFP感染性克隆。将其体外转录制备的病毒全长RNA转染Marc-145细胞后,拯救获得了表达EGFP的重组病毒(r Hu N4-F112-EGFP)。将r Hu N4-F112-EGFP在Marc-145细胞中进行连续传代至20代,其外源gfp基因仍能够持续表达,表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。与亲本病毒Hu N4-F112相比,重组病毒在病毒滴度、空斑形态等方面差异不显著;病毒生长曲线的结果显示,重组病毒具有良好的增殖能力。本研究结果表明,在PRRSV的ORF1b和ORF2a基因区中插入外源基因并未影响该病毒体外复制,该非必需基因区的鉴定为进一步研究以PRRSV疫苗为活病毒载体多价重组疫苗的研发奠定基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒重组病毒增强性绿色荧光蛋白

表达O型口蹄疫病毒保护性抗原表位重组PRRSV的构建及其鉴定

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生物工程学报 2012年第12期28卷 1431-1440页

作者：童武徐彦召周艳君姜一峰张善瑞王亚欣朱建平虞凌雪孙晶陈焕春童光志中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

以高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的感染性分子克隆（rHuN4-F112）作为载体，将O型口蹄疫病毒（FMDV）VPl基因的421～480nt（141～160aa）和598～639nt（200～213aa）两优势保护性抗原表位串联成的目的基因，通过突变PCR的方法插入... 详细信息

以高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的感染性分子克隆（rHuN4-F112）作为载体，将O型口蹄疫病毒（FMDV）VPl基因的421～480nt（141～160aa）和598～639nt（200～213aa）两优势保护性抗原表位串联成的目的基因，通过突变PCR的方法插入Nsp2中的508～532位缺失区域，经体外转录后转染至BHK-21细胞中培养36h，将上清接种至MARC-145细胞中培养，并在MARC-145细胞中连续传代，拯救重组病毒。经RT-PCR扩增，MluI酶切及测序验证，结果表明插入的外源基因及人为突变的Mlu1分子标记都正确，说明重组病毒拯救成功，且该重组病毒能够在MARC-145细胞中稳定传代，将此重组病毒命名为rPRRSV-F112-O／VPlep。rPRRsv-F112-O／VPlep能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变，间接免疫荧光检测表明外源基因在该病毒中成功获得了表达。经过生物学特性分析，该病毒的TCID50=-log10-6.75／0．1mL，且在MARC-145细胞中整体生长速度与其亲本病毒rHuN4-Fll2（△508-532）相似，但明显高于rHuN4-F112病毒。

关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒 O型口蹄疫病毒感染性分子克隆重组病毒

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猪流行性腹泻病毒N基因的表达及抗原性分析

中国预防兽医学报 2013年第4期35卷 299-303页

作者：吴玉璐朱建平杨莘王亚欣徐彦召虞凌雪于海刘光清童光志周艳君中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为深入了解仔猪腹泻的病因,本研究在不同发病猪场采集了115份临床样品,通过RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行检测,结果显示总阳性率为81.7%。进一步从部分样品中对PEDV的N基因进行克隆和序列分析,结果显示采集的临床样品中各分... 详细信息

为深入了解仔猪腹泻的病因,本研究在不同发病猪场采集了115份临床样品,通过RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行检测,结果显示总阳性率为81.7%。进一步从部分样品中对PEDV的N基因进行克隆和序列分析,结果显示采集的临床样品中各分离株之间的氨基酸同源性高达99%以上,与代表性病毒株CV777的氨基酸同源性为97.4%～98.1%,表明目前流行的PEDV其N基因仍然相对保守的。同时,构建了重组表达载体pGEX-N,经诱导表达显示该重组蛋白呈可溶性表达,重组蛋白大小约为81 ku,western blot分析结果表明该重组蛋白能够被PEDV阳性猪血清特异性识别。将纯化后的重组N蛋白作为包被抗原,对20份已知背景的临床猪血清抗体进行ELISA检测,结果显示有9份血清为抗体阳性,11份血清呈抗体阴性,与应用RT-PCR方法鉴定抗原的结果符合率为85%。本研究表达的重组N蛋白具有良好的抗原性,可以将其作为PEDV血清学诊断的候选抗原。

关键词：猪流行性腹泻病毒重组N蛋白抗原性分析

表达猪源GM-CSF蛋白的重组PRRSV构建及鉴定

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中国预防兽医学报 2014年第4期36卷 260-264页

作者：虞凌雪周艳君姜一峰童武高飞夏天奇王康杨莘李丽薇程群童光志中国农业科学院上海兽医研究所猪病研究室上海200241

为提高猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)弱毒疫苗的免疫效果,本研究以高致病性PRRS弱毒疫苗株HuN4-F112感染性分子克隆为基础,在NSP2区域删除了110个氨基酸,将猪源GM-CSF基因和PRRSV ORF6转录引导序列(TRS6)通过融合PCR方法插入HuN4-F112... 详细信息

为提高猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)弱毒疫苗的免疫效果,本研究以高致病性PRRS弱毒疫苗株HuN4-F112感染性分子克隆为基础,在NSP2区域删除了110个氨基酸,将猪源GM-CSF基因和PRRSV ORF6转录引导序列(TRS6)通过融合PCR方法插入HuN4-F112疫苗株的ORF1b和ORF2a之间,构建了全长重组质粒pHN4-△110-GM-CSF。将该重组质粒采用SwaⅠ酶切线性化,经体外转录病毒基因组RNA后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中进行病毒拯救及传代。结果显示重组病毒感染Marc-145细胞可以引起明显的细胞病变;经RT-PCR、DNA测序、MluⅠ酶切鉴定和免疫荧光鉴定结果显示,救获的重组PRRSV含有GM-CSF基因并能够有效表达,将其命名为rHN4-△110-GM-CSF。生物学特性分析表明重组病毒与亲本病毒在Marc-145细胞中具有相似的生长特性,插入的外源基因具有良好的遗传稳定性。由于GM-CSF能够活化树突状细胞,是一种良好的免疫佐剂。该重组病毒的构建为动物体内免疫保护攻毒试验评价奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GM-CSF rHN4-△ 110-GM-CSF

猪源转录因子SP1 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2022年

作者：沈奇虞凌雪高飞刘长龙周艳君李国新童光志李丽薇姜一峰中国农业科学院上海兽医研究所江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

SP1作为MHC Ⅱ类分子反式激活因子CIITA的关键上游转录调控因子，在抗原递呈细胞的分化成熟和功能实现过程中发挥着至关重要的作用。本研究建立了一种高效检测猪源转录因子SP1的方法，提取猪骨髓细胞的RNA反转录成cDNA，以其为模板克隆... 详细信息

SP1作为MHC Ⅱ类分子反式激活因子CIITA的关键上游转录调控因子，在抗原递呈细胞的分化成熟和功能实现过程中发挥着至关重要的作用。本研究建立了一种高效检测猪源转录因子SP1的方法，提取猪骨髓细胞的RNA反转录成cDNA，以其为模板克隆到SP1的片段并连接到Pcaggs载体上，得到重组质粒Pcaggs-SP1。测得质粒浓度并根据公式计算拷贝数，稀释成10;～10;copies/μL的标准品质粒，从而建立SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。试验结果表明：该方法在10;～10;copies/μL范围内呈现出良好的线性关系；与常规PCR 相比，敏感性提高了1000倍；该方法仅能够检测到猪源细胞中的SP1基因，与其他物种细胞无交叉反应；组内和组间变异系数均小于1%，重复性好。利用该方法对PRRSV接毒的PAM细胞样品进行检测，结果显示SP1转录水平被下调。本试验结果表明，猪源转录因子SP1 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，可用于猪源SP1基因的定量检测，为进一步研究猪病病原微生物在感染过程中的免疫逃逸机制提供了准确有效的工具。

关键词：猪源SP1 荧光定量PCR SYBR Green I

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猪德尔塔冠状病毒昆明小鼠感染模型的建立

中国动物传染病学报 2023年

作者：宋俊菡王元红邓小莺王俊娜虞凌雪王斌周艳君童光志李国新中国农业科学院上海兽医研究所默沙东(宁波)动物保健科技有限公司

为了建立猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染昆明小鼠模型，本研究用PDCoV(JS2211株)对8周龄SPF级雌性昆明小鼠进行了感染试验。感染组接种病毒原液(107.6TCID50/mL)，灌胃200uL，肌肉注射100uL；对照组经相同方式接种等体积的生理盐水。每日... 详细信息

为了建立猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染昆明小鼠模型，本研究用PDCoV(JS2211株)对8周龄SPF级雌性昆明小鼠进行了感染试验。感染组接种病毒原液(107.6TCID50/mL)，灌胃200uL，肌肉注射100uL；对照组经相同方式接种等体积的生理盐水。每日观察小鼠临床症状，并在感染后的第1、3、5、7、10、14、21d，随机选取3只感染组小鼠及1只对照组小鼠，采集脏器进行组织病理学观察，并通过qRT-PCR测定不同脏器病毒分布情况。结果显示，感染组小鼠在第7d、14d和21d出现肠道充气、水肿，肠壁变薄，肠道及肠系膜出血；组织病理学观察显示，感染14d小鼠肠绒毛部分缺损脱落，绒毛密度低、变短、肠壁变薄，肠系膜有明显出血现象，胃黏膜上皮细胞浅表伴有少许糜烂、脱落，并可见大量炎性细胞浸润；qRT-PCR检测发现PDCoV主要入侵小鼠肠道组织，且在感染14d时，病毒水平达到峰值。本研究为抗PDCoV生物制品及药物的有效性评价建立了良好的动物模型。

关键词：猪德尔塔冠状病毒昆明小鼠动物模型

猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

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中国农业科学 2013年第20期46卷 4370-4377页

作者：吴玉璐程群虞凌雪侯怡轩王康刘光清童光志周艳君中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室上海交通大学农业与生物学院

【目的】利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒(PEDV)自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进... 详细信息

【目的】利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒(PEDV)自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95.8%—97.1%。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基因,其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300 bp,而弱毒疫苗株则为250 bp左右;该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增,其敏感性可达到100TCID50/0.1mL,对仔猪腹泻临床样品检测结果显示,PEDV自然感染的阳性率为65.4%。【结论】初步建立了基于PEDV ORF3基因的RT-PCR鉴别诊断方法,该方法可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株,为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速的检测方法。

关键词：猪流行性腹泻病毒 ORF3基因 RT-PCR 鉴别诊断

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX14T2毒株的分离与鉴定

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中国动物传染病学报 2016年第2期24卷 1-7页

作者：王鑫杨德强张文超姜一峰虞凌雪杨莘高飞李丽薇黄勤峰童光志周艳君中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

江西省某猪场育肥猪群出现高热、呼吸困难和死亡等症状,为确定疫病病原,本实验室从发病猪场随机采取20份病死猪血样和组织,用RT-PCR的方法进行病原检测.结果显示,19份临床样品呈现猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and res... 详细信息

江西省某猪场育肥猪群出现高热、呼吸困难和死亡等症状,为确定疫病病原,本实验室从发病猪场随机采取20份病死猪血样和组织,用RT-PCR的方法进行病原检测.结果显示,19份临床样品呈现猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）阳性.随后对病死猪肺组织进行病毒分离,结果显示分离的第1代病毒感染后48 h即可出现典型的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,对传至第5代的病毒进行RT-PCR检测和间接免疫荧光鉴定,结果证实我们分离获得的病毒为PRRSV,命名为JX14T2.将JX14T2 P5代次的病毒与高致病性PRRSV强、弱毒代表株进行生长特性比较分析,结果显示,JX14T2在Marc-145细胞上形成的细胞病变、病毒噬斑形态以及病毒增殖动态均与HP-PRRSV毒株相似.对JX14T2进行全长基因测序和序列比较分析,结果表明JX14T2基因组全长14960 bp,属于北美型毒株,其NSP2除存在的1＋29个氨基酸的缺失而外,在598-717 aa还存在120个氨基酸的缺失,与HP-PRRSV亲缘关系较近.本研究结果为掌握PRRSV流行情况以及致病机制提供了科学依据.

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 JX14T2 分离鉴定