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黄颡鱼小RNA病毒qPCR检测方法的建立与应用

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病毒学报 2023年第4期39卷 1062-1071页

作者：穆雪姣潘晓艺周可欣蔺凌云姚嘉赟沈锦玉浙江海洋大学舟山316022 浙江省淡水水产研究所、农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室、浙江省鱼类健康与营养重点实验室湖州313001

黄颡鱼小RNA病毒(Yellow catfish Picornavirus,YCPrV)是黄颡鱼重要的致死性病原,本研究旨在建立一种快速、精准的YCPrV检测方法。基于YCPrV 22426⁃8毒株RdRp基因编码区序列设计特异性引物和探针,通过质粒标准品和标准曲线的制作,反应... 详细信息

黄颡鱼小RNA病毒(Yellow catfish Picornavirus,YCPrV)是黄颡鱼重要的致死性病原,本研究旨在建立一种快速、精准的YCPrV检测方法。基于YCPrV 22426⁃8毒株RdRp基因编码区序列设计特异性引物和探针,通过质粒标准品和标准曲线的制作,反应体系和反应条件的优化,灵敏度和特异性的测试,建立一种检测YCPrV的TaqMan荧光定量PCR(qPCR)方法。结果显示,在绘制的qPCR标准曲线中,拷贝数与Ct值具有良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9974,扩增效率为88.98%,最高检测灵敏度为5.09×10^(0)拷贝。该方法对来自黄颡鱼、鲫鱼、鲤鱼和虾的其它8种病毒无扩增信号,仅YCPrV具有扩增曲线,对临床样品阳性检出率比普通PCR高12.28%。自然感染黄颡鱼组织中YCPrV检测结果发现,病毒载量从高到低依次为肠、肾、心、肝、脾、鳃和脑。以上结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度和可重复性,临床检测YCPrV时,建议优选肾和心作为检测靶标组织。YCPrV qPCR方法的建立,可为YCPrV的精准定量检测和疾病早期预防提供有利手段。

关键词：黄颡鱼小RNA病毒病毒性出血病 TaqMan荧光定量PCR

柑橘绿霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和功能分析

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柑橘绿霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和功能分析

作者：蔺凌云浙江大学

学位级别：硕士

果胶酶是植物病原物突破植物细胞壁的主要细胞壁降解酶之一。真菌多聚半乳糖醛酸酶（endopolygalacturonase,PG）作为主要的果胶酶成员,可以降解植物细胞壁的主要成分同源半乳糖聚糖,在一些真菌和植物互作系统中被证明是真菌的致病因子... 详细信息

果胶酶是植物病原物突破植物细胞壁的主要细胞壁降解酶之一。真菌多聚半乳糖醛酸酶（endopolygalacturonase,PG）作为主要的果胶酶成员,可以降解植物细胞壁的主要成分同源半乳糖聚糖,在一些真菌和植物互作系统中被证明是真菌的致病因子,决定病菌的致病性,但在另一些互作系统中,单个多聚半乳糖醛酸酶基因的敲除并没有导致病菌致病力的下降。柑橘绿霉病（Penicillum digitatum Sacc.）的互作体系不同于已研究的真菌—植物互作体系,即病菌只能从伤口侵入,只能为害成熟的柑橘果实,寄主不是植物体,是果皮富含果胶并逐渐衰老的离体果实。虽然没有实验证据,但从病害软腐症状判断,水解酶应该参与致病过程。为证实在柑橘绿霉菌—柑橘这个特殊互作系统中柑橘绿霉菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶是否参与致病过程,本研究根据已报道的柑橘绿霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因（Pdpg1）序列设计合成特异性引物,从基因组DNA中扩增获得Pdpg1的全长基因。氨基酸序列分析表明：Pdpg1与其他真菌如Penicillum olsonii的pgl（79%）和Penicillum griseoroseum的pgl（85%）等具有较高的同源性,其开放阅读框为1101bp,包括3个外显子和2个内含子,编码蛋白的N端有一段长为18个氨基酸的信号肽序列。表达分析表明Pdpg1是一个组成型基因,其表达不受葡萄糖的抑制。Real-time PCR分析结果表明,Pdpg1是一个酸性表达基因,pH 4.0时表达水平最高,大约是pH 7.0的15倍。论文构建了Pdpg1基因敲除载体ΔPdpg1和过表达载体EX-vector,应用根癌土壤农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法转化柑橘绿霉菌菌株Pdw03,获得的转化子ΔPdpg1-10,ΔPdpg1-38,EX-3,Etc-2经PCR和Southern bloting验证,确定为Pdpg1基因敲除、过表达及异位插入突变体。实验表明,在常规的PDA培养基上,Pdpg1基因敲除和过表达突变体与野生型亲本菌株Pdw03在菌落特征/菌丝生长速率和分生孢子产生上没有显著的不同。但在果胶（诱导）培养基上培养15天,野生型和各突变体均未产孢,敲除突变体的生长速度明显慢于野生型菌株,而过表达及异位插入突变体的生长速度与野生型没有显著性差异。Pdpg1基因敲除突变体的果胶酶活性比野生型降低了26%,过表达突变体的酶活性比野生型提高了26%,插入突变体与野生型非常接近,没有差异。Pdpg1基因敲除和过表达突变体,以及野生型菌株分别刺伤接种柑橘果实,结果显示：敲除突变体,过表达突变体较野生型病斑直径均没有显著性差异。可见,虽然离体条件下,Papg1缺失导致多聚半乳糖醛酸酶分泌的显著下降,Pdpg1基因的过表达导致多聚半乳糖醛酸酶分泌的显著上升,但这些变化并没有直接导致其致病性的下降或者上升。由此推断,单个多聚半乳糖醛酸酶基因在柑橘绿霉菌菌的致病过程并没有起到关键性的作用。

关键词：多聚半乳糖醛酸酶基因表达基因敲除基因过表达果胶酶活性致病性

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拟态弧菌最新研究进展

黑龙江畜牧兽医 2022年第13期 32-37页

作者：孙玉峰蔺凌云单晓枫钱爱东姚嘉赟康元环吉林农业大学动物医学院/动物生产及产品质量安全教育部重点实验室长春130118 浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省鱼类健康与营养重点实验室浙江湖州313001

拟态弧菌(Vibrio mimicus,V.mimicus)是一种重要的人和水生动物共患病原菌,该菌不仅能引起水生动物的溃疡病、腹水病等,也能引起人的腹泻、中耳炎等,严重威胁公共卫生安全。文章主要从病原学、临床特征、国内外流行现状、诊断检测技术... 详细信息

拟态弧菌(Vibrio mimicus,V.mimicus)是一种重要的人和水生动物共患病原菌,该菌不仅能引起水生动物的溃疡病、腹水病等,也能引起人的腹泻、中耳炎等,严重威胁公共卫生安全。文章主要从病原学、临床特征、国内外流行现状、诊断检测技术、致病机理、防控技术等方面对拟态弧菌进行综述,旨在为有效防控拟态弧菌提供参考。

关键词：拟态弧菌临床特征毒力因子致病机制防控技术

SCC-37 37℃驯化的稳定性及其在常见病毒培养中的应用

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水产学报 2023年

作者：巩金鹏赵颖陈雪兰蔺凌云姚嘉赟穆雪姣周可欣王丛旭沈锦玉潘晓艺上海海洋大学水产与生命学院浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室浙江省鱼类健康与营养重点实验室湖州市南浔区农业技术推广服务中心

为建立能快速增殖且对常见病毒敏感的鳜鱼细胞系。实验利用已建立的鳜脊髓组织细胞系SCC，采用梯度血清逐步驯化的方式，建立一个连续细胞系SCC-37，分析该连续细胞系的来源、支原体污染、生长特性和冻存后细胞活力，评估其对传染性脾... 详细信息

为建立能快速增殖且对常见病毒敏感的鳜鱼细胞系。实验利用已建立的鳜脊髓组织细胞系SCC，采用梯度血清逐步驯化的方式，建立一个连续细胞系SCC-37，分析该连续细胞系的来源、支原体污染、生长特性和冻存后细胞活力，评估其对传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、鳜虹彩病毒(SCRaV)和鳜弹状病毒(SCRV)的敏感性。结果显示，该细胞系SCC-37已连续培养30代，稳定的生长条件为L-15+10%NBCS、37 ℃培养；通过鳜28S rRNA基因分析其来源于鳜，支原体检测证实SCC-37无支原体污染；病毒敏感性结果表明，ISKNV、SCRaV和SCRV可在SCC-37中稳定增殖和传代，培养的病毒滴度在103.4至109.6TCID50/mL之间，电镜观察可见大量病毒颗粒。总之，新驯化的SCC-37为分离、鉴定和增殖病毒以及疫苗制备提供了重要工具。

关键词：鳜鳜脊髓组织细胞系 37℃驯化生长特性敏感性

鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)灭活疫苗制备及其免疫效力测定

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海洋与湖沼 2022年第5期53卷 1143-1150页

作者：潘晓艺蔺凌云朱悦姚嘉赟尹文林刘忆瀚陈凡沈锦玉浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室浙江省鱼类健康与营养重点实验室浙江湖州313001 浙江海洋大学水产学院浙江舟山316022 杭州市农业技术推广中心浙江杭州310001

鲫造血器官坏死病是由鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)引起的危害我国养殖鲫鱼(Carassius auratus)最严重的病毒性疾病。为制备有效预防鲫造血器官坏死病的灭活疫苗,以CyHV-2代表流行株CNDF-TB2015为疫苗株,以CSC细胞系进行病毒增殖,并采用不同... 详细信息

鲫造血器官坏死病是由鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)引起的危害我国养殖鲫鱼(Carassius auratus)最严重的病毒性疾病。为制备有效预防鲫造血器官坏死病的灭活疫苗,以CyHV-2代表流行株CNDF-TB2015为疫苗株,以CSC细胞系进行病毒增殖,并采用不同浓度的病毒对不同规格鲫鱼进行攻毒,建立攻毒模型。结果表明,培养的病毒滴度达10^(10)TCID_(50)/mL,以4×10^(7)TCID_(50)/尾的剂量腹腔注射感染体重300 g的鲫鱼可造成100%的死亡率。对病毒灭活剂甲醛、β-丙内酯和BEI灭活条件进行筛选优化,对疫苗免疫佐剂763A、IMS1312、铝胶和M402进行筛选,结果表明,浓度为10^(8.3) TCID_(50)/mL的病毒液最佳灭活条件为终浓度10 mmol/L的BEI 37℃灭活72 h,疫苗制备最佳佐剂为水佐剂IMS1312。对灭活疫苗的最小免疫剂量、最佳免疫剂量和有效免疫产生期进行测定,结果表明,要获得70%以上保护率的最小免疫剂量为8×10^(6)TCID_(50)/尾,最佳免疫剂量为4×10^(7)TCID_(50)/尾,在免疫4周后保护率可达80%,5周后保护率达到100%。制备的灭活疫苗为鲫造血器官坏死病的免疫预防提供了有力手段,也为其他水产动物病毒灭活疫苗的制备提供了借鉴。

关键词：鲤疱疹病毒2型鲫造血器官坏死病灭活疫苗免疫效力

弥合全球化时代比较教育研究的问题鸿沟——重审本土意识与国际视野之关系

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比较教育研究 2024年第5期46卷 55-63,94页

作者：俞凌云南京师范大学教育科学学院江苏南京210097

识别与选择具有全球化时代张力的研究问题是推进比较教育学科现代化与科学化进程的重要环节。在当前的比较教育研究成果中,由于缺乏对本土意识与国际视野关系的多维审思,问题感的匮乏和问题情景的脱嵌已成为全球化时代比较教育研究发展... 详细信息

识别与选择具有全球化时代张力的研究问题是推进比较教育学科现代化与科学化进程的重要环节。在当前的比较教育研究成果中,由于缺乏对本土意识与国际视野关系的多维审思,问题感的匮乏和问题情景的脱嵌已成为全球化时代比较教育研究发展的现实困境。为了建构与完善问题识别的逻辑框架,比较教育研究者须基于本土与国际的对话、超越以及融合不同立场,从理论与实践的互动、问题的双重历史化以及行动空间的建构出发,确立研究的多元问题化路径。在问题识别的基础上,全球化时代的比较教育研究还须转换研究策略,借助问题式的比较教育研究实现全球教育的理解与对话,并通过沟通式的比较教育研究保持对研究问题的长期追索,以此发挥知识生产对社会发展的积极作用。

关键词：比较教育研究本土意识国际视野问题化路径

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鼓室硬化治疗的研究进展

临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2024年第1期38卷 86-90页

作者：王新梅凌云蒋璐中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科长沙410008 耳鼻咽喉重大疾病湖南省重点实验室

鼓室硬化是鼓膜固有层及中耳黏膜下层在长期慢性炎性刺激下发生的透明变性和钙质沉着。目前治疗主要依靠手术清除硬化灶及听骨链重建,但当清除累及面神经骨管、前庭窗龛等重要结构的硬化灶时,可能导致面瘫、眩晕及感音神经性耳聋等术后... 详细信息

鼓室硬化是鼓膜固有层及中耳黏膜下层在长期慢性炎性刺激下发生的透明变性和钙质沉着。目前治疗主要依靠手术清除硬化灶及听骨链重建,但当清除累及面神经骨管、前庭窗龛等重要结构的硬化灶时,可能导致面瘫、眩晕及感音神经性耳聋等术后并发症。如何能更安全有效地治疗鼓室硬化成为国内外的研究目标。近年来在治疗手段上有一些新的探索,为此,本文对鼓室硬化治疗的最新研究进展进行综述。

关键词：鼓室硬化手术治疗 2-巯基乙磺酸钠

社会系统理论视域下美国人文社会科学跨学科组织的建设模式研究——以区域研究、女性研究和数据研究为例

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外国教育研究 2024年第2期51卷 94-111页

作者：俞凌云南京师范大学教育科学学院江苏南京210097

从尼克拉斯·卢曼的社会系统理论视角出发,美国社会发展所提出的功能分化要求催动了其大学系统通过自我指涉进行跨学科组织的建设。在这一过程中,推动组织发展的核心力量以及大学对组织发展目标的定位影响了美国大学系统在区域研究、女... 详细信息

从尼克拉斯·卢曼的社会系统理论视角出发,美国社会发展所提出的功能分化要求催动了其大学系统通过自我指涉进行跨学科组织的建设。在这一过程中,推动组织发展的核心力量以及大学对组织发展目标的定位影响了美国大学系统在区域研究、女性研究和数据研究组织建设的功能理解和路径选择。由于组织的建设基础以及需要应对的核心问题存在差异,三类跨学科组织分别确立了不同的建设模式:区域研究组织形成了以横向切分研究对象为基础的功能式系统分化模式,女性研究组织选择了以不同水平融入传统学科系组织的层级式系统分化模式,数据研究组织则表现出具有组织独立性与功能一致性的分割式系统分化模式。

关键词：美国社会系统理论人文社会科学跨学科组织区域研究女性研究数据研究

基于SecA基因的鰤鱼诺卡氏菌qPCR检测方法的建立及进化分析

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水生生物学报 2023年第10期47卷 1553-1560页

作者：周可欣潘晓艺蔺凌云黄雷穆雪姣王丛旭姚嘉赟劳顺健沈锦玉上海海洋大学水产与生命学院上海201200 浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室浙江省鱼类健康与营养重点实验室湖州313001 湖州市农业科技发展中心湖州313000

为对诺卡氏菌病进行快速早期诊断,建立了鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)TaqMan qPCR检测方法。以鰤鱼诺卡氏菌的管家基因SecA为靶标设计引物和探针,对反应条件进行优化,制作标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性测试,并将建立的方法... 详细信息

为对诺卡氏菌病进行快速早期诊断,建立了鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)TaqMan qPCR检测方法。以鰤鱼诺卡氏菌的管家基因SecA为靶标设计引物和探针,对反应条件进行优化,制作标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性测试,并将建立的方法应用于临床样品的检测。结果表明,优化后,引物和探针终浓度分别为0.3和0.1μmol/L,退火延伸温度60℃时,qPCR在9.85×1010—9.85×100copies内呈良好的线性关系,灵敏度最高达9.85 copies;重复性实验结果显示,组间和组内变异系数均小于1%;特异性结果表明,对无乳链球菌、弗氏柠檬酸杆菌和维氏气单胞菌等13种病菌均无扩增曲线;临床对42份大口黑鲈样品进行检测,结果表明,qPCR检出率比普通PCR提高14.24%;对发病大口黑鲈的组织及结节部位检测显示,结节部位菌载量大幅高于非结节部位,最高相差1000倍;SecA基因分析结果显示,SecA基因在传代中和种内高度保守,种间具有一定的离散性,是个很好的用于诺卡氏菌种鉴定的靶基因。研究建立的鰤鱼诺卡氏菌qPCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好,可用于对鰤鱼诺卡氏菌病的早期诊断和定量检测,为诺卡氏菌病的早诊断早治疗提供了有效手段。

关键词：鰤鱼诺卡氏菌 qPCR 诺卡氏菌病大口黑鲈